Epidemiology and genetic diversity of lagomorph-infecting treponemes in Europe
Seiten
2025
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-7259-9 (ISBN)
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-7259-9 (ISBN)
Ziel dieser Arbeit war die Verbreitung und genetische Vielfalt von Lagomorph-infizierenden Treponemen in ganz Europa zu untersuchen. Treponemen sind gramnegative spiralförmige Bakterien, die ubiquitär in der Umwelt vorkommen, als Symbionten leben oder Krankheiten bei Menschen und Tieren verursachen können. Pathogene, nicht kultivierbare Treponemen sind morphologisch nicht unterscheidbar und umfassen das den Menschen infizierende Treponema pallidum, mit seinen Unterarten pallidum, pertenue und endemicum, T. carateum und T. paraluisleporidarum, welches Lagomorphen infiziert.
Die epidemiologische Untersuchung umfasste ein Screening auf Treponema-Antikörper oder eine quantitative PCR, falls keine Serumproben zur Verfügung standen. Die Proben stammten aus acht europäischen Ländern: Deutschland, Ungarn, Spanien, Italien, den Niederlanden, der Tschechischen Republik, dem Vereinigten Königreich und Schweden. Sie wurden entweder selbst gesammelt oder von Jägern und Mitarbeitern von Veterinäruntersuchungsämtern bereitgestellt. Die Probenentnahme umfasste die postmortale Blutentnahme aus dem Herzen, vaginale Abstriche bei weiblichen Tieren und die Entfernung des Penis bei männlichen Tieren. Bei Syphilis-typischen Läsionen (n = 20) wurde ebenfalls das entsprechende Material isoliert.
Als Erstes wurden alle Serumproben mit dem zum Screening geeigneten Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest getestet, und das eine Auswahl von Proben anschließend mit dem spezifischen Fluoreszenz Treponemen Antikörper Absorptionstest bestätigt. Aufgrund der antigenen Kreuzreaktivität zwischen T. pallidum und T. paraluisleporidarum sind beide Tests auch zum Einsatz an Proben von Lagomorphen geeignet. DNA aus Gewebe- und Abstrichmaterial wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Für den Fall, dass keine Serumproben verfügbar waren, wurde eine sondenbasierte qPCR durchgeführt, die auf das Polymerase-I-Gen abzielte.
Zur Bestätigung der Wirtsspezies wurden bei zugesendete Proben zwei Regionen des Immunoglobin heavy chain-Gens (IGHGCH2 und IGHG-Hinge) sequenziert und mit veröffentlichten Daten verglichen. Die Multi-Locus-Sequenztypisierung umfasste die Amplifikation von zwei Treponemen-Genen: tp0488, das für das methyl-accepting chemotaxis-Protein 2 kodiert, und tp0548, das für ein hypothetisches Membranprotein kodiert. Die Gelelektrophorese identifizierte Amplikons der richtigen Größe (~830 bp für tp0488 und ~1070 bp für tp0548), die anschließend mit dem QIAquick Gel Extraction Kit extrahiert wurden. Die Sanger-Sequenzierung wurde vom Microsynth Laboratory durchgeführt. Um die mitochondrialen Genome (mt-Genome) zu generieren, wurden zwei Long-Range-PCRs von 95 zufällig ausgewählten Proben aus allen Probenahmestellen durchgeführt und die resultierenden DNA-Amplikons mit SPRISelect-Magnetkügelchen gereinigt. Die PCR-Produkte wurden gepoolt, fragmentiert und für die Illumina MiSeq-Sequenzierung vorbereitet. Die Sequenzdaten wurden mit dem 4Peaks Sequence Viewer und Geneious Prime ausgewertet, analysiert und abgeglichen, positiv selektierte Loci identifiziert und exkludiert. Die phylogenetischen Bäume wurden mithilfe von IQ Tree, MrBayes und Grape Tree Software generiert.
In allen Probenursprungsländern konnten Infektionen mit T. paraluisleporidarum nachgewiesen werden. Insgesamt wurden 1.230/2.729 Sera positiv getestet, während 182/287 Proben positive qPCR Ergebnisse erbrachten. Erwachsene Hasen waren signifikant häufiger seropositiv als Jungtiere, das Geschlecht der Tiere machte jedoch keinen Unterschied. Obwohl 8/11 Wild- und 3/5 Hauskaninchenproben Amplifikationen in der qPCR zeigten, konnten in keiner der Serumproben von Kaninchen aus Katalonien, Spanien, Antikörper nachgewiesen werden. Neben den bekannten Wirten Feldhase und Wildkaninchen wurden auch bei vier Schneehasen aus Schweden und zwei Korsikahasen aus Sizilien T. paraluisleporidarum- DNA nachgewiesen.
Die Multi-Locus-Sequenztypisierung ergab eine auffallend hohe genetische Diversität, die möglicherweise durch den positiven Selektionsdruck an beiden Loci erklärt werden kann. Während es sich bei den Unterschieden innerhalb des tp0488-Gens meist um Variationen einzelner Nukleotide handelte, umfasste die Variation innerhalb von tp0548 zwei hochvariable Regionen, die in humanpathogenen Spezies nicht vorkommen. Obwohl positiv selektierte Loci von der phylogenetischen Analyse ausgeschlossen wurden, konnte keine Clusterbildung nach geografischer Herkunft festgestellt werden. Die generierten mt-Genome sprechen für eine panmiktische Hasenpopulation in Mittel-/Westeuropa, die sich jedoch von griechischen und anatolischen Tieren unterscheidet. Nachfolgende Studien müssen effektive MLST-Loci erforschen, da tp0488 und tp0548 aufgrund des positiven Selektionsdruckes und folglich große genetische Variabilität ungeeignet sind. Die in dieser Arbeit beschriebene Beteiligung mehrerer Lagomorpha-Arten, das weite geografische Verbreitungsgebiet und die hohe genetische Vielfalt sprechen für einen endemischen Charakter von T. paraluisleporidarum in europäischen Lagomorphen.
This thesis investigated the distribution and genetic relationship of lagomorph-infecting treponemes throughout Europe. Treponemes are gram-negative spiral-shaped bacteria that can occur ubiquitously in the environment, are symbionts, or cause diseases in humans or animals. Pathogenic uncultivable treponemes are morphologically indistinguishable from each other and include the human-infecting Treponema pallidum with its subspecies pallidum, pertenue and endemicum, T. carateum and lagomorph-infecting T. paraluisleporidarum.
The epidemiological investigation included screening for anti-treponemal antibodies and quantitative PCR from tissue material in case no serum was available. Samples originated from eight European countries: Germany, Hungary, Spain, Italy, the Netherlands, the Czech Republic, the United Kingdom, and Sweden, and were both self-collected and contributed by collaborators, hunters, and veterinary investigation office employees. Sample acquisition included post-mortem blood drawing from the heart, vaginal swabbing in females, and removal of the penis in male animals. The respective material was also isolated in the case of typical lesions (n = 20).
Epidemiological analysis of all serum samples was performed with the Treponema pallidum particle agglutination assay, and a selection of samples was subsequently tested with the confirmatory FTA-ABS test. Both tests are suited due to the antigenic cross-reactivity between T. pallidum and T. paraluisleporidarum. DNA from tissue and swab material was extracted using QIAamp DNA mini kit according to instructions by the manufacturer. Probe-based qPCR targeting the polymerase I gene was performed in case no serum samples were available.
Third-party samples were subject to host genus confirmatory PCR targeting two regions on the immunoglobulin heavy chain gene (IGHGCH2 and IGHG hinge). The multi-locus sequence typing included amplification of two treponemal genes: tp0488, coding for the methyl accepting chemotaxis protein 2 and tp0548 coding for a hypothetical membrane protein. Gel electrophoresis identified Amplicons of the right size (~830bp for tp0488 and ~1070bp for tp0548) that were then extracted using QIAquick Gel extraction Kit. Sanger Sequencing was performed by the Microsynth Laboratory service. To generate the mt- genomes, two long range PCR of 95 randomly selected samples from all sampling sites were performed and the resulting DNA amplicons purified using SPRISelect magnetic beads. The PCR products were pooled, fragmented and prepared for Illumina MiSeq sequencing. Sequence data were evaluated, analyzed, and aligned using 4Peaks sequence viewer and Geneious Prime, positively selected sites identified and excluded and subsequent phylogenetic tree building conducted using IQ Tree, MrBayes, and Grape tree software.
We found evidence of treponemal infection in all countries where samples originated from. Altogether, 1,230/2,729 sera tested positive for anti-treponemal antibodies, while 182/287 samples, subjected to qPCR, produced positive results. Adult hares were seropositive significantly more often than juveniles, the animals’ gender however, did not make a difference. While 8/11 wild and 3/5 domestic rabbit samples were qPCR positive, rabbit serum samples from Catalonia, Spain, unexpectedly did not generate any positive result. Additionally to European brown hares and European rabbits, four mountain hares from Sweden and two Corsican hares from Sicily were found to be infected with T. paraluisleporidarum.
Multi-locus sequence typing revealed a strikingly high genetic diversity possibly explainable by the positive selection pressure found on both loci. While differences within the tp0488 gene were primarily single nucleotide variations, the variation within tp0548 included two highly variable regions not present in human-pathogenic strains. Although positively selected sites were excluded from phylogenetic analysis, no clustering based on geographic origin could be detected. Correspondingly, the generated mt-genomes argue for a panmictic hare population within Central/ Western Europe that is distinct from Greek and Turkish animals. Effective MLST loci have yet to be determined, as tp0488 and tp0548 were found to be unsuitable. However, the involvement of multiple lagomorph species, the extensive geographic range, and the substantial genetic diversity found in this work all argue for the endemic character of treponemes in European lagomorphs.
Die epidemiologische Untersuchung umfasste ein Screening auf Treponema-Antikörper oder eine quantitative PCR, falls keine Serumproben zur Verfügung standen. Die Proben stammten aus acht europäischen Ländern: Deutschland, Ungarn, Spanien, Italien, den Niederlanden, der Tschechischen Republik, dem Vereinigten Königreich und Schweden. Sie wurden entweder selbst gesammelt oder von Jägern und Mitarbeitern von Veterinäruntersuchungsämtern bereitgestellt. Die Probenentnahme umfasste die postmortale Blutentnahme aus dem Herzen, vaginale Abstriche bei weiblichen Tieren und die Entfernung des Penis bei männlichen Tieren. Bei Syphilis-typischen Läsionen (n = 20) wurde ebenfalls das entsprechende Material isoliert.
Als Erstes wurden alle Serumproben mit dem zum Screening geeigneten Treponema pallidum-Partikelagglutinationstest getestet, und das eine Auswahl von Proben anschließend mit dem spezifischen Fluoreszenz Treponemen Antikörper Absorptionstest bestätigt. Aufgrund der antigenen Kreuzreaktivität zwischen T. pallidum und T. paraluisleporidarum sind beide Tests auch zum Einsatz an Proben von Lagomorphen geeignet. DNA aus Gewebe- und Abstrichmaterial wurde mit dem QIAamp DNA Mini Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Für den Fall, dass keine Serumproben verfügbar waren, wurde eine sondenbasierte qPCR durchgeführt, die auf das Polymerase-I-Gen abzielte.
Zur Bestätigung der Wirtsspezies wurden bei zugesendete Proben zwei Regionen des Immunoglobin heavy chain-Gens (IGHGCH2 und IGHG-Hinge) sequenziert und mit veröffentlichten Daten verglichen. Die Multi-Locus-Sequenztypisierung umfasste die Amplifikation von zwei Treponemen-Genen: tp0488, das für das methyl-accepting chemotaxis-Protein 2 kodiert, und tp0548, das für ein hypothetisches Membranprotein kodiert. Die Gelelektrophorese identifizierte Amplikons der richtigen Größe (~830 bp für tp0488 und ~1070 bp für tp0548), die anschließend mit dem QIAquick Gel Extraction Kit extrahiert wurden. Die Sanger-Sequenzierung wurde vom Microsynth Laboratory durchgeführt. Um die mitochondrialen Genome (mt-Genome) zu generieren, wurden zwei Long-Range-PCRs von 95 zufällig ausgewählten Proben aus allen Probenahmestellen durchgeführt und die resultierenden DNA-Amplikons mit SPRISelect-Magnetkügelchen gereinigt. Die PCR-Produkte wurden gepoolt, fragmentiert und für die Illumina MiSeq-Sequenzierung vorbereitet. Die Sequenzdaten wurden mit dem 4Peaks Sequence Viewer und Geneious Prime ausgewertet, analysiert und abgeglichen, positiv selektierte Loci identifiziert und exkludiert. Die phylogenetischen Bäume wurden mithilfe von IQ Tree, MrBayes und Grape Tree Software generiert.
In allen Probenursprungsländern konnten Infektionen mit T. paraluisleporidarum nachgewiesen werden. Insgesamt wurden 1.230/2.729 Sera positiv getestet, während 182/287 Proben positive qPCR Ergebnisse erbrachten. Erwachsene Hasen waren signifikant häufiger seropositiv als Jungtiere, das Geschlecht der Tiere machte jedoch keinen Unterschied. Obwohl 8/11 Wild- und 3/5 Hauskaninchenproben Amplifikationen in der qPCR zeigten, konnten in keiner der Serumproben von Kaninchen aus Katalonien, Spanien, Antikörper nachgewiesen werden. Neben den bekannten Wirten Feldhase und Wildkaninchen wurden auch bei vier Schneehasen aus Schweden und zwei Korsikahasen aus Sizilien T. paraluisleporidarum- DNA nachgewiesen.
Die Multi-Locus-Sequenztypisierung ergab eine auffallend hohe genetische Diversität, die möglicherweise durch den positiven Selektionsdruck an beiden Loci erklärt werden kann. Während es sich bei den Unterschieden innerhalb des tp0488-Gens meist um Variationen einzelner Nukleotide handelte, umfasste die Variation innerhalb von tp0548 zwei hochvariable Regionen, die in humanpathogenen Spezies nicht vorkommen. Obwohl positiv selektierte Loci von der phylogenetischen Analyse ausgeschlossen wurden, konnte keine Clusterbildung nach geografischer Herkunft festgestellt werden. Die generierten mt-Genome sprechen für eine panmiktische Hasenpopulation in Mittel-/Westeuropa, die sich jedoch von griechischen und anatolischen Tieren unterscheidet. Nachfolgende Studien müssen effektive MLST-Loci erforschen, da tp0488 und tp0548 aufgrund des positiven Selektionsdruckes und folglich große genetische Variabilität ungeeignet sind. Die in dieser Arbeit beschriebene Beteiligung mehrerer Lagomorpha-Arten, das weite geografische Verbreitungsgebiet und die hohe genetische Vielfalt sprechen für einen endemischen Charakter von T. paraluisleporidarum in europäischen Lagomorphen.
This thesis investigated the distribution and genetic relationship of lagomorph-infecting treponemes throughout Europe. Treponemes are gram-negative spiral-shaped bacteria that can occur ubiquitously in the environment, are symbionts, or cause diseases in humans or animals. Pathogenic uncultivable treponemes are morphologically indistinguishable from each other and include the human-infecting Treponema pallidum with its subspecies pallidum, pertenue and endemicum, T. carateum and lagomorph-infecting T. paraluisleporidarum.
The epidemiological investigation included screening for anti-treponemal antibodies and quantitative PCR from tissue material in case no serum was available. Samples originated from eight European countries: Germany, Hungary, Spain, Italy, the Netherlands, the Czech Republic, the United Kingdom, and Sweden, and were both self-collected and contributed by collaborators, hunters, and veterinary investigation office employees. Sample acquisition included post-mortem blood drawing from the heart, vaginal swabbing in females, and removal of the penis in male animals. The respective material was also isolated in the case of typical lesions (n = 20).
Epidemiological analysis of all serum samples was performed with the Treponema pallidum particle agglutination assay, and a selection of samples was subsequently tested with the confirmatory FTA-ABS test. Both tests are suited due to the antigenic cross-reactivity between T. pallidum and T. paraluisleporidarum. DNA from tissue and swab material was extracted using QIAamp DNA mini kit according to instructions by the manufacturer. Probe-based qPCR targeting the polymerase I gene was performed in case no serum samples were available.
Third-party samples were subject to host genus confirmatory PCR targeting two regions on the immunoglobulin heavy chain gene (IGHGCH2 and IGHG hinge). The multi-locus sequence typing included amplification of two treponemal genes: tp0488, coding for the methyl accepting chemotaxis protein 2 and tp0548 coding for a hypothetical membrane protein. Gel electrophoresis identified Amplicons of the right size (~830bp for tp0488 and ~1070bp for tp0548) that were then extracted using QIAquick Gel extraction Kit. Sanger Sequencing was performed by the Microsynth Laboratory service. To generate the mt- genomes, two long range PCR of 95 randomly selected samples from all sampling sites were performed and the resulting DNA amplicons purified using SPRISelect magnetic beads. The PCR products were pooled, fragmented and prepared for Illumina MiSeq sequencing. Sequence data were evaluated, analyzed, and aligned using 4Peaks sequence viewer and Geneious Prime, positively selected sites identified and excluded and subsequent phylogenetic tree building conducted using IQ Tree, MrBayes, and Grape tree software.
We found evidence of treponemal infection in all countries where samples originated from. Altogether, 1,230/2,729 sera tested positive for anti-treponemal antibodies, while 182/287 samples, subjected to qPCR, produced positive results. Adult hares were seropositive significantly more often than juveniles, the animals’ gender however, did not make a difference. While 8/11 wild and 3/5 domestic rabbit samples were qPCR positive, rabbit serum samples from Catalonia, Spain, unexpectedly did not generate any positive result. Additionally to European brown hares and European rabbits, four mountain hares from Sweden and two Corsican hares from Sicily were found to be infected with T. paraluisleporidarum.
Multi-locus sequence typing revealed a strikingly high genetic diversity possibly explainable by the positive selection pressure found on both loci. While differences within the tp0488 gene were primarily single nucleotide variations, the variation within tp0548 included two highly variable regions not present in human-pathogenic strains. Although positively selected sites were excluded from phylogenetic analysis, no clustering based on geographic origin could be detected. Correspondingly, the generated mt-genomes argue for a panmictic hare population within Central/ Western Europe that is distinct from Greek and Turkish animals. Effective MLST loci have yet to be determined, as tp0488 and tp0548 were found to be unsuitable. However, the involvement of multiple lagomorph species, the extensive geographic range, and the substantial genetic diversity found in this work all argue for the endemic character of treponemes in European lagomorphs.
| Erscheinungsdatum | 13.11.2025 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Verlagsort | Gießen |
| Sprache | englisch |
| Maße | 148 x 210 mm |
| Gewicht | 200 g |
| Themenwelt | Veterinärmedizin ► Allgemein |
| Schlagworte | Europa • Feldhase • Genetische Diversität • genitale oder kutane Läsionen • Hasen • Hasenartigen • Hauskaninchen • Korsikahasen • Lagomorpha • Molekulare Epidemiologie • Multi-Locus-Sequenztypisierung (MLST) • Schneehase • Syphilis • T. pallidum • T. paraluisleporidarum • Treponema paraluisleporidarum • Wildkaninchen |
| ISBN-10 | 3-8359-7259-6 / 3835972596 |
| ISBN-13 | 978-3-8359-7259-9 / 9783835972599 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
| Haben Sie eine Frage zum Produkt? |
Mehr entdecken
aus dem Bereich
aus dem Bereich
Buch | Softcover (2025)
Mensch & Buch (Verlag)
CHF 69,85
