In vitro und in vivo Effekte modifizierter Oligodesoxynukleotide im humanen Pankreaskarzinommodell
Seiten
2004
|
1., Aufl.
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-89820-657-0 (ISBN)
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-89820-657-0 (ISBN)
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Krebs ist keine einheitliche Krankheit. Der Begriff „Krebs“ steht für maligne Tumore, die sich von benignen Tumoren durch infiltratives und destruktives Wachstum, sowie der Fähigkeit zur Metastasenbildung unterscheiden (WAGENER, 1996). Jeder Zelltyp, jedes Gewebe kann zum Ausgangspunkt von Krebs werden, mit eigener Wachstumsgeschwindigkeit, eigener Prognose und eigenen Therapiemöglichkeiten (VARMUS und WEINBERG, 1992).
Die molekulare Onkologie beschäftigt sich mit den spezifischen genetischen Veränderungen in malignen Tumoren. Erkenntnisse zur Funktion von Tumorgenen und Tumorproteinen haben entscheidend zum Verständnis der molekularen und zellbiologischen Grundlagen des malignen Wachstums beigetragen. Darauf basierend werden neue Ansätze zur Diagnose und Therapie bösartiger Tumore entwickelt (WAGENER, 1996).
Bei den Haustieren ist Krebs die häufigste Todesursache. Es ist eine vor allem bei älteren Tieren auftretende Krankheit, deren Häufigkeit korrelierend mit der steigenden Lebenserwartung der Haustiere zunimmt. Mit dieser Entwicklung steigt gleichzeitig die Bereitschaft und der Wunsch seitens der Tierbesitzer zur Behandlung der Krebserkrankungen an (KESSLER, 1999). Mittlerweile gibt es schon ein breites Behandlungsspektrum und zunehmend rationale Methoden, neoplastische Erkrankungen zu beurteilen, um genauere Prognosen stellen zu können. Nach der kurativen Intention ist bei Haustieren vor allem die Verbesserung der Lebensqualität das vorrangige Ziel der Krebstherapie neben der Verlängerung der Überlebenszeit (NOLTE, 1999).
In der Humanmedizin sind Krebserkrankungen heutzutage die zweithäufigste Todesursache nach den Krankheiten des Herz-Kreislaufsystems und werden nach derzeitigen Prognosen in 15-20 Jahren sogar die häufigste sein. Jährlich erkranken in Deutschland ca. 340.000 Personen an Krebs und mehr als 210.000 versterben daran (Stand 1999; Krebsregister, 2002). Die Situation der Krebsbehandlung ist also nach wie vor unbefriedigend. Trotz intensiver Bemühungen können viele Krebserkrankungen bis heute nicht geheilt werden (BECKER und WAHRENDORF, 1998). Die heutzutage angewandte Therapie solider Tumore ist - soweit möglich - in erster Linie die chirurgische Behandlung sowie unterstützend oder gegebenenfalls alleine die Radio- und Chemotherapie. Allerdings ist nach dem heutigen Stand der Wissenschaft eine ausschließlich auf Tumorzellen wirkende, nebenwirkungsarme und sichere Radio- oder Chemotherapie nicht möglich, so dass die Erforschung neuer Therapieansätze für eine selektive Behandlung entarteter Zellen mit wenig Nebenwirkungen für den Gesamtorganismus von großer Bedeutung ist.
Neue Therapiekonzepte werden überwiegend für die Anwendung in der Humanmedizin erforscht. Für die Entwicklung und Erforschung eines neuen Therapiekonzeptes ist die Testung in komplexen Organismen, wie sie Versuchstiere bieten, vor einer Übertragung auf den Menschen noch immer unersetzlich. Die Veterinärmedizin zieht ihren Nutzen daraus, da sich häufig die meist in Tierversuchen erprobten humanmedizinischen Therapien als gut übertragbar bezüglich ihrer Anwendung beim Haustier erweisen.
Das Karzinom des exokrinen Pankreas ist die sechsthäufigste Krebstodesursache in Deutschland (Krebsregister, 2002). Die Erkrankung ist mit einer globalen
5-Jahresüberlebensrate von unter 2% durch eine sehr ungünstige Prognose gekennzeichnet (ARIMYA et al., 1990). Die einzige kurative Maßnahme ist bislang die chirurgische Therapie (Kausch-Whipple-OP mit Lymphadenektomie) mit 5-Jahres-Überlebensraten von 10% - 20% (WAGNER et al., 1999; HENNE-BRUNS et al., 1998), in einzelnen Studien auch bis zu 30% (TREDE, 1998). Neben der Metastasierung in Lymphknoten und Leber stellt das Lokalrezidiv hierbei das entscheidende Problem dar. Der chirurgischen Therapie können aufgrund der häufig erst im fortgeschrittenem Stadium gestellten Diagnose nur
ca. 15% der Patienten zugeführt werden (WAGNER et al., 1999). Andere standard-onkologische Therapieverfahren wie die Chemotherapie, die Radiotherapie oder deren Kombination, die bei anderen Tumorerkrankungen erfolgreich eingesetzt werden, zeigen beim Pankreaskarzinom eine sehr limitierte Wirkung (KETTERER et al., 1998). Bislang konnte durch ihre Anwendung in der adjuvanten oder palliativen Therapie das Überleben der Patienten nicht oder nur geringfügig gesteigert werden (BÖHMING et al., 1999). Somit kommt der Entwicklung neuer adjuvanter oder palliativer Therapieansätze eine besondere Bedeutung zu.
Die Resultate der molekularbiologischen Forschung haben das Verständnis des Pankreasadenokarzinoms verbessert, wenngleich noch viele Aspekte des komplexen Gesamtzusammenhanges der malignen Transformation unaufgeklärt sind. Im Zusammenhang mit der Tumorentstehung und -proliferation treten verschiedene genetische Veränderungen mit konsekutiver Aktivierung oder Inaktivierung der entsprechenden
Gene auf.
Ein Ansatz, diese Veränderungen therapeutisch zu nutzen, besteht in der Inaktivierung der mRNA mutierter Gene, indem kurzkettige Nukleinsäuren mit komplementärer Basensequenz, sogenannte Antisense-Oligodesoxynukleotide (AON), in die Zelle eingeschleust werden. In bis zu 73% der Pankreasadenokarzinome ist das Tumorsuppressorgen p53 mutiert (KALTHOFF et al., 1993), woraus nicht nur der Funktionsverlust der Tumorsuppressorfunktion sondern auch ein Zugewinn an onkogener Aktivität resultieren kann (DITTMER et al., 1993).
Mittels eines anti-p53 AON konnte die Proliferation von Pankreaskarzinomzelllinien in vitro, sowie auch das Primärtumorgewicht bzw. –volumen eines Pankreasadenokarzinoms im orthotopen Xenotransplantationsmodell (SCID Mäuse) reduziert werden (FIEDLER et al., 1998; TEPEL et al., 2002).
In der vorliegenden Arbeit werden die antitumoralen Effekte ausgewählter modifizierter Oligodesoxynukleotide (MON) im humanen Pankreaskarzinomsystem in vitro und in vivo untersucht. Zuerst wird vergleichend analysiert, welche Oligodesoxynukleotidsequenz (Antisense- und Kontrollsequenzen) mit welchen terminalen Modifikationen (Polyethylenglycol, Hexaethylenglycol, Tocopherol) in vitro eine möglichst effiziente antiproliferative und apoptoseinduzierende Wirkung auf Pankreaskarzinomzellen zeigt. Anschließend wird die proliferationshemmende und zytotoxische Wirkung des selektierten modifizierten Oligodesoxynukleotids (Eviton) auf verschiedene Pankreaskarzinom-zelllinien und Normalzellen mittels 3H-Thymidin-Inkorporations- und colorimetrischen Zytotoxizitätsassays gemessen. Die Apoptoseinduktion wird durch 3H-Thymidin-DNA-Fragmentierungsassays und durch Zellzyklusanalyse in der Durchflusszytometrie bestimmt. Des Weiteren wird in vitro die Wirkung von Eviton auf humane Pankreaskarzinomzellen in Abhängigkeit von der Serumkonzentration im Zellkulturmedium untersucht. Die antitumoralen Effekte von Eviton werden mit denen von Gemcitabine in vitro verglichen und eine potentielle Wirkungssteigerung durch die Kombination der beiden Substanzen überprüft.
Der antitumorale Effekt und die Nebenwirkungen des in vitro selektierten MON (Eviton) werden in vivo im orthotopen Xenotransplantationsmodell (SCID-bg Mäuse) untersucht. Hierzu werden humane Pankreaskarzinomzellen intrapankreatisch inokuliert und nach Etablierung eines soliden Tumors Eviton in unterschiedlicher Dosierung und mit verschiedenen Applikationsmodi injiziert. Die Verminderung des Tumorgewichtes nach Eviton-Behandlung wird dokumentiert und das Tumorgewebe immunhistochemisch gefärbt.
Die zelluläre Aufnahme und subzelluläre Verteilung von Cy3-markierten ON wird in vitro und in vivo mittels Fluoreszenzmikroskopie und in vitro zusätzlich die intrazelluläre Anreicherung in der Durchflusszytometrie analysiert.
Erste Hinweise auf den möglichen, bislang ungeklärten Wirkmechanismus von Eviton soll eine Untersuchung der differenziellen Genexpression im DNA-Array von mit Eviton behandelten Pankreaskarzinomzellen geben.
Derzeit gibt es in der Literatur keine veröffentlichten Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen, die in vitro oder in vivo die therapeutischen Effekte des MON Eviton® (als Patent angemeldet) im humanen Pankreaskarzinomsystem untersucht haben.
Die molekulare Onkologie beschäftigt sich mit den spezifischen genetischen Veränderungen in malignen Tumoren. Erkenntnisse zur Funktion von Tumorgenen und Tumorproteinen haben entscheidend zum Verständnis der molekularen und zellbiologischen Grundlagen des malignen Wachstums beigetragen. Darauf basierend werden neue Ansätze zur Diagnose und Therapie bösartiger Tumore entwickelt (WAGENER, 1996).
Bei den Haustieren ist Krebs die häufigste Todesursache. Es ist eine vor allem bei älteren Tieren auftretende Krankheit, deren Häufigkeit korrelierend mit der steigenden Lebenserwartung der Haustiere zunimmt. Mit dieser Entwicklung steigt gleichzeitig die Bereitschaft und der Wunsch seitens der Tierbesitzer zur Behandlung der Krebserkrankungen an (KESSLER, 1999). Mittlerweile gibt es schon ein breites Behandlungsspektrum und zunehmend rationale Methoden, neoplastische Erkrankungen zu beurteilen, um genauere Prognosen stellen zu können. Nach der kurativen Intention ist bei Haustieren vor allem die Verbesserung der Lebensqualität das vorrangige Ziel der Krebstherapie neben der Verlängerung der Überlebenszeit (NOLTE, 1999).
In der Humanmedizin sind Krebserkrankungen heutzutage die zweithäufigste Todesursache nach den Krankheiten des Herz-Kreislaufsystems und werden nach derzeitigen Prognosen in 15-20 Jahren sogar die häufigste sein. Jährlich erkranken in Deutschland ca. 340.000 Personen an Krebs und mehr als 210.000 versterben daran (Stand 1999; Krebsregister, 2002). Die Situation der Krebsbehandlung ist also nach wie vor unbefriedigend. Trotz intensiver Bemühungen können viele Krebserkrankungen bis heute nicht geheilt werden (BECKER und WAHRENDORF, 1998). Die heutzutage angewandte Therapie solider Tumore ist - soweit möglich - in erster Linie die chirurgische Behandlung sowie unterstützend oder gegebenenfalls alleine die Radio- und Chemotherapie. Allerdings ist nach dem heutigen Stand der Wissenschaft eine ausschließlich auf Tumorzellen wirkende, nebenwirkungsarme und sichere Radio- oder Chemotherapie nicht möglich, so dass die Erforschung neuer Therapieansätze für eine selektive Behandlung entarteter Zellen mit wenig Nebenwirkungen für den Gesamtorganismus von großer Bedeutung ist.
Neue Therapiekonzepte werden überwiegend für die Anwendung in der Humanmedizin erforscht. Für die Entwicklung und Erforschung eines neuen Therapiekonzeptes ist die Testung in komplexen Organismen, wie sie Versuchstiere bieten, vor einer Übertragung auf den Menschen noch immer unersetzlich. Die Veterinärmedizin zieht ihren Nutzen daraus, da sich häufig die meist in Tierversuchen erprobten humanmedizinischen Therapien als gut übertragbar bezüglich ihrer Anwendung beim Haustier erweisen.
Das Karzinom des exokrinen Pankreas ist die sechsthäufigste Krebstodesursache in Deutschland (Krebsregister, 2002). Die Erkrankung ist mit einer globalen
5-Jahresüberlebensrate von unter 2% durch eine sehr ungünstige Prognose gekennzeichnet (ARIMYA et al., 1990). Die einzige kurative Maßnahme ist bislang die chirurgische Therapie (Kausch-Whipple-OP mit Lymphadenektomie) mit 5-Jahres-Überlebensraten von 10% - 20% (WAGNER et al., 1999; HENNE-BRUNS et al., 1998), in einzelnen Studien auch bis zu 30% (TREDE, 1998). Neben der Metastasierung in Lymphknoten und Leber stellt das Lokalrezidiv hierbei das entscheidende Problem dar. Der chirurgischen Therapie können aufgrund der häufig erst im fortgeschrittenem Stadium gestellten Diagnose nur
ca. 15% der Patienten zugeführt werden (WAGNER et al., 1999). Andere standard-onkologische Therapieverfahren wie die Chemotherapie, die Radiotherapie oder deren Kombination, die bei anderen Tumorerkrankungen erfolgreich eingesetzt werden, zeigen beim Pankreaskarzinom eine sehr limitierte Wirkung (KETTERER et al., 1998). Bislang konnte durch ihre Anwendung in der adjuvanten oder palliativen Therapie das Überleben der Patienten nicht oder nur geringfügig gesteigert werden (BÖHMING et al., 1999). Somit kommt der Entwicklung neuer adjuvanter oder palliativer Therapieansätze eine besondere Bedeutung zu.
Die Resultate der molekularbiologischen Forschung haben das Verständnis des Pankreasadenokarzinoms verbessert, wenngleich noch viele Aspekte des komplexen Gesamtzusammenhanges der malignen Transformation unaufgeklärt sind. Im Zusammenhang mit der Tumorentstehung und -proliferation treten verschiedene genetische Veränderungen mit konsekutiver Aktivierung oder Inaktivierung der entsprechenden
Gene auf.
Ein Ansatz, diese Veränderungen therapeutisch zu nutzen, besteht in der Inaktivierung der mRNA mutierter Gene, indem kurzkettige Nukleinsäuren mit komplementärer Basensequenz, sogenannte Antisense-Oligodesoxynukleotide (AON), in die Zelle eingeschleust werden. In bis zu 73% der Pankreasadenokarzinome ist das Tumorsuppressorgen p53 mutiert (KALTHOFF et al., 1993), woraus nicht nur der Funktionsverlust der Tumorsuppressorfunktion sondern auch ein Zugewinn an onkogener Aktivität resultieren kann (DITTMER et al., 1993).
Mittels eines anti-p53 AON konnte die Proliferation von Pankreaskarzinomzelllinien in vitro, sowie auch das Primärtumorgewicht bzw. –volumen eines Pankreasadenokarzinoms im orthotopen Xenotransplantationsmodell (SCID Mäuse) reduziert werden (FIEDLER et al., 1998; TEPEL et al., 2002).
In der vorliegenden Arbeit werden die antitumoralen Effekte ausgewählter modifizierter Oligodesoxynukleotide (MON) im humanen Pankreaskarzinomsystem in vitro und in vivo untersucht. Zuerst wird vergleichend analysiert, welche Oligodesoxynukleotidsequenz (Antisense- und Kontrollsequenzen) mit welchen terminalen Modifikationen (Polyethylenglycol, Hexaethylenglycol, Tocopherol) in vitro eine möglichst effiziente antiproliferative und apoptoseinduzierende Wirkung auf Pankreaskarzinomzellen zeigt. Anschließend wird die proliferationshemmende und zytotoxische Wirkung des selektierten modifizierten Oligodesoxynukleotids (Eviton) auf verschiedene Pankreaskarzinom-zelllinien und Normalzellen mittels 3H-Thymidin-Inkorporations- und colorimetrischen Zytotoxizitätsassays gemessen. Die Apoptoseinduktion wird durch 3H-Thymidin-DNA-Fragmentierungsassays und durch Zellzyklusanalyse in der Durchflusszytometrie bestimmt. Des Weiteren wird in vitro die Wirkung von Eviton auf humane Pankreaskarzinomzellen in Abhängigkeit von der Serumkonzentration im Zellkulturmedium untersucht. Die antitumoralen Effekte von Eviton werden mit denen von Gemcitabine in vitro verglichen und eine potentielle Wirkungssteigerung durch die Kombination der beiden Substanzen überprüft.
Der antitumorale Effekt und die Nebenwirkungen des in vitro selektierten MON (Eviton) werden in vivo im orthotopen Xenotransplantationsmodell (SCID-bg Mäuse) untersucht. Hierzu werden humane Pankreaskarzinomzellen intrapankreatisch inokuliert und nach Etablierung eines soliden Tumors Eviton in unterschiedlicher Dosierung und mit verschiedenen Applikationsmodi injiziert. Die Verminderung des Tumorgewichtes nach Eviton-Behandlung wird dokumentiert und das Tumorgewebe immunhistochemisch gefärbt.
Die zelluläre Aufnahme und subzelluläre Verteilung von Cy3-markierten ON wird in vitro und in vivo mittels Fluoreszenzmikroskopie und in vitro zusätzlich die intrazelluläre Anreicherung in der Durchflusszytometrie analysiert.
Erste Hinweise auf den möglichen, bislang ungeklärten Wirkmechanismus von Eviton soll eine Untersuchung der differenziellen Genexpression im DNA-Array von mit Eviton behandelten Pankreaskarzinomzellen geben.
Derzeit gibt es in der Literatur keine veröffentlichten Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen, die in vitro oder in vivo die therapeutischen Effekte des MON Eviton® (als Patent angemeldet) im humanen Pankreaskarzinomsystem untersucht haben.
| Sprache | deutsch |
|---|---|
| Maße | 148 x 210 mm |
| Einbandart | gebunden |
| Themenwelt | Veterinärmedizin |
| Schlagworte | TB/Medizin/Veterinärmedizin |
| ISBN-10 | 3-89820-657-2 / 3898206572 |
| ISBN-13 | 978-3-89820-657-0 / 9783898206570 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
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