Expressionsanalyse, zelluläre Lokalisierung und proteinbiochemische Charakterisierung des porzinen CLCA-Homologen pCLCA4a - Unterschiede zu seinen Orthologen bei Mensch und Maus?
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-86387-270-0 (ISBN)
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Der porzine CLCA-Vertreter pCLCA4a ist ein Mitglied der CLCA (engl.: chloride channel regulators, calcium-activated) - Familie, die Anfang der 1990er Jahre entdeckt wurde. Bislang ist es gelungen, 17 Mitglieder in sechs verschiedenen Spezies zu identifizieren und zu charakterisieren. Die Mitglieder dieser Proteinfamilie induzieren unter anderem eine Ca2+- abhängige Chloridleitfähigkeit in transient transfizierten Säugetierzellen und scheinen die Anionenströme anderer bislang unbekannter Proteine indirekt zu beeinflussen. Ebenso scheinen CLCA-Proteine in Pathomechanismen bei Krankheiten mit sekretorischen Dysfunktionen wie der Mukoviszidose (Zystische Fibrose, engl.: cystic fibrosis, CF) und dem Asthma involviert zu sein. Die CF ist eine tödlich verlaufende Erbkrankheit beim Menschen, bei der durch eine gestörte Chloridionensekretion die Zusammensetzung der Sekrete in den exokrinen Drüsen verändert wird. Dies führt unter anderem zu einem progressiven Lungenleiden (Riordan et al., 1989). Einige Mitglieder dieser Proteinfamilie stehen aber auch im Verdacht als Tumorsuppressoren zu funktionieren (Elble und Pauli, 2001), andere CLCA-Vertreter hingegen könnten die Adhäsion invasiver Tumorzellen vermitteln (Abdel-Ghany et al., 2001, 2002 und 2003). Das Verteilungsmuster der einzelnen Mitglieder innerhalb des Organismus ist ebenso komplex wie ihre postulierte Funktionaliät. So variiert das Expressionsmuster der CLCA-Proteine innerhalb der Homologen einer Spezies und differiert ebenfalls im Vergleich zu ihren eng verwandten Orthologen in anderen Spezies. Bezüglich der Transmembranstruktur wird die Existenz zweier strukturell unterschiedlicher Gruppen von CLCA-Proteinen postuliert. Demnach besitzt die eine Gruppe eine carboxy-terminale Transmembrandomäne, bei der lediglich der Amino (N) -Terminus partiell sezerniert wird. Bei der anderen Gruppe handelt es sich um vollständig sezernierte Proteine, die folglich keine Transmembrandomäne aufweisen (Elble et al., 2006; Gibson et al., 2005). Die Einordnung in einer dieser beiden Gruppen ist für ein weiteres Verständnis zum Funktionsmechanismus des jeweiligen CLCA-Proteins von Bedeutung. Die vielfältigen Eigenschaften der CLCA-Proteine in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen bergen eine hohe biomedizinische Relevanz und machen sie für viele Wissenschaftler zu einem interessanten Forschungsthema. Auch in dieser Arbeit werden sie Gegenstand der Analyse sein. Jüngste Studien postulierten für den humanen pCLCA4a-Orthologen hCLCA4 eine potenzielle Modulatorfunktion bei der CF (Ritzka et al., 2004). Für den membranverankerten murinen Orthologen mCLCA6 konnte eine zelluläre Kolokalisation mit dem murinen CFTR-Chloridkanal (engl.: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) beschrieben werden (Bothe et al., 2008), was ebenfalls für eine Modulatorfunktion bei der phänotypischen Ausprägung der CF sprechen könnte. Interessanterweise weicht das Expressionsmuster dieser beiden eng verwandten Orthologen erheblich voneinander ab. Während hCLCA4-mRNA unter anderem signifikant im oberen Respirationstrakt exprimiert ist, fehlt seinem murinen Orthologen mCLCA6 hingegen die Expression in diesem Organsystem völlig. Lediglich im Darmtrakt sind beide Orthologe übereinstimmend vertreten (Agnel et al., 1999; Evans et al., 2004; Bothe et al., 2008). Diese speziesübergreifenden Expressionsvarianten bringen möglicherweise ebenso unterschiedliche Funktionsweisen nahe verwandter Proteine in verschiedenen Spezies mit sich. Dadurch wird die speziesübergreifende Übertragbarkeit von Daten erheblich eingeschränkt. Dies ist im Rahmen der translationalen Forschung zu beachten. Denn die Etablierung geeigneter Tiermodelle, die in der Lage sind, humane Krankheitsbilder möglichst exakt nachzuahmen, ist für diesen Forschungszweig von entscheidener Bedeutung. Mittels der bisher genutzten CF-Mausmodelle ist es nur unzureichend gelungen, die humane CF-Klinik widerzuspiegeln. Insbesondere wird der für die CF-Forschung so wichtige respiratorische CF-Phänotyp von CFTR-knockout-Mausmodellen nicht widergespiegelt (Elferink und Beuers, 2009). Kürzlich generierte CF-Schweine hingegen zeigen alle wichtigen humanen CF-Organveränderungen (Khansaheb et al., 2011; Rogan et al., 2010; Ostedgaard et al., 2011; Itan et al., 2011; Cho et al., 2011). Somit werden CFTR-genveränderte Schweine eventuell ein bedeutsames Tiermodell für die humane CF darstellen. Die möglicherweise größere Homologie zwischen pCLCA4a und hCLCA4 würde das Schwein als Tiermodell zur Erforschung der Rolle von CLCA-Proteinen bei der CF durchaus geeigneter erscheinen lassen als die Maus. Innerhalb dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass ein porziner Orthologe zu hCLCA4 bzw. mCLCA6 als funktionelles Protein exprimiert wird. Aufgrund der genetisch engen Verwandtschaft zwischen den drei Orthologen bestehen bezüglich des Expressionsmusters und der proteinbiochemischen Charakteristika Ähnlichkeiten. Hypothetisiert wird weiter, dass der Mensch und das Schwein dabei viel größere Übereinstimmungen aufweisen als der Mensch und die Maus. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, für den porzinen CLCA-Vertreter pCLCA4a einerseits sein mRNA-Expressionsmuster mit Hilfe der konventionellen Polymerase-Kettenreaktion zu ermitteln und andererseits nach Generierung spezifischer anti-pCLCA4a-Antikörper mittels Immunhistochemie ein gewebespezifisches Expressionsmuster des Proteins bei gesunden Schweinen zu ermitteln. Darüber hinaus wurde das Glykosylierungsmuster und der sekretorische Weg des pCLCA4a-Proteins durch die Zelle proteinbiochemisch bestimmt. Zusätzliche computergestützte Analysen sollten klären, ob pCLCA4 in die Gruppe der EinTransmembran-CLCA-Proteine eingzuordnen ist oder ob es sich um ein vollständig sezerniertes Protein handelt. Die ermittelten Daten zu dem neuen Mitglied pCLCA4a wurden schließlich mit denen der bekannten humanen und murinen Orthologen verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass pCLCA4a und hCLCA4 übereinstimmende Expressionen im Respirations- und im Darmtrakt aufweisen. mCLCA6 fehlt dagegen die Expression im Respirationstrakt. Desweiteren handelt es sich bei pCLCA4a um ein posttranslational gespaltenes Protein, das mit einer Transmembrandomäne membranverankert vorliegt. Die neu gewonnenen Erkenntnisse zu pCLCA4a, das möglicherweise eine ebenso hohe biomedizinische Bedeutung im CF-Schweinemodell besitzen könnte wie sein orthologer Vertreter hCLCA4 bei der humanen CF, bieten eine solide Basis für nachfolgende Studien zur Bedeutung dieses Proteins als Modulator der Chloridleitfähigkeit im porzinen Tiermodell und erlauben möglicherweise Rückschlüsse auf die Rolle von hCLCA4 bei der humanen CF. In der vorliegenden Dissertationsschrift wird dem Leser zunächst einleitend der aktuelle Forschungsstand zum Thema nähergebracht. Auf dieser Basis werden nachfolgend die angewendeten molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden und die erzielten Ergebnisse zur Charakterisierung von pCLCA4a erläutert. Die gewonnenen Erkenntnisse werden schließlich hinsichtlich ihrer daraus resultierenden Konsequenzen diskutiert.
| Sprache | deutsch |
|---|---|
| Einbandart | gebunden |
| Themenwelt | Veterinärmedizin |
| Schlagworte | CLCA-Proteine • Homologe • Immunhistochemie • Orthologe • pCLCA4a • Polymerase-Kettenreaktion • Proteinfamilie |
| ISBN-10 | 3-86387-270-3 / 3863872703 |
| ISBN-13 | 978-3-86387-270-0 / 9783863872700 |
| Zustand | Neuware |
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