Development of a microfluidic device for mitochondria isolation from cell culture
Seiten
2016
|
1. Aufl.
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-86387-688-3 (ISBN)
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-86387-688-3 (ISBN)
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Mitochondria play a fundamental role in the energy metabolism of most eukaryotes. In the previous studies, the intermediates of the cytosol and the mitochondria are usually sampled together as one pool. Due to the lack of separate experimental data, the dynamics and regulatory mechanism in mitochondria and those at the conjunction of cytosol and mitochondria are thus poorly understood. The difficulties lie partly in the realization of effective methods or devices for fractionation of the cell lysate. Standard methods such as differential centrifugation or electrophoresis cannot produce samples under physiological conditions. For proteomic studies, these methods are not specific enough and require extensive time to be performed.
This work introduces a new, affinity based method for isolation of mitochondria on a micro scale after cell disruption. The device comprises of linear micro channels cast in Polydimethylsiloxane (PDMS) and sealed with glass. Using immobilized specific antibodies, mitochondria can be captured in the channel, whereas the remains of the lysate flow out the chip unhindered. Here, successful immobilizations of preconcentrated mitochondria and mitochondria directly from cell lysates are demonstrated. The device was characterized optically using fluorescence microscopy. To better understand the dynamics of the adhesion, a mathematical model was developed. The model was based on the antibody-antigen reaction and included the effect of flow rate on mitochondria immobilization. The model was able to describe the experimental results satisfactorily and is useful for further experimental design. The experimental and the modeling results showed that the yield was influenced by the sampling time, the antibody concentration on the surface, the mitochondria concentration in the sample, as well as the flow rate used during sampling. Further, it is possible to directly observe and analyze the mitochondria on chip without the need to elute them first, e.g. for in-vitro assays on chip. As a proof of principle, in vitro respiration analysis of immobilized mitochondria was performed on chip. The immobilized mitochondria were highly active and able to utilize mitochondrial respiration substrates to produce Adenosine triphosphate (ATP). It was also shown that several segments of the channel can be modified separately from each other. Multiple biomarkers could thus be immobilized in different segments of the channel so that simultaneous observation of different mitochondrial proteins or organelles is possible. Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Energiegewinnung vieler eukaryotischer Zellen. Jedoch werden bis heute die Intermediate vom Zytosol und von Mitochondrien als eine Gesamtheit betrachtet. Aufgrund von fehlenden experimentellen Daten konnten die Dynamik und die regulatorischen Mechanismen in Mitochondrien, beziehungsweise an der Schnittstelle zwischen Zytosol und Mitochondrien bislang noch nicht vollständig geklärt werden. Eine der Schwierigkeiten liegt in der Fraktionierung des hochkomplexen und heterogenen Zelllysats. Standardlabormethoden, wie z.B. die Differentialzentrifugation oder die Elektrophorese können keine Proben unter physiologischen Bedingungen erzeugen. Für Proteomstudien sind diese Methoden nicht spezifisch genug und zudem sehr zeitintensiv.
In dieser Arbeit wurde eine neue mikrofluidische Isolationsmethode für Mitochondrien nach der Zelllyse entwickelt. Die Methode nutzt die Affinität zwischen Antigenen und Antikörpern. Der Mikrochip besteht aus linearen Kanälen in PDMS, welche mit einem Deckglas abgedichtet werden. Spezifische Antikörper gegen Mitochondrien sind auf der Kanaloberfläche immobilisiert, so dass die Mitochondrien in den Kanälen zurückgehalten werden, während der Rest des Zelllysats ungehindert weiterfließen kann. In dieser Arbeit wurde die erfolgreiche Immobilisierung von vorkonzentrierten Mitochondrien sowie Mitochondrien direkt aus dem Zelllysat gezeigt. Der Mikrochip wurde optisch mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Für ein besseres Verständnis der Bindungsdynamik wurde außerdem ein mathematisches Modell erstellt. Das Model basiert auf der Antikörper-Antigen Bindungsreaktion und berücksichtigt den Effekt der Flussrate auf die Immobilisierung der Mitochondrien. Das Modell konnte die experimentellen Daten gut nachbilden und ist für weiteres Experimentdesign sehr nützlich. Sowohl in den experimentellen, als auch in den Simulationsergebnissen wurde gezeigt, dass die Ausbeute von der Probenahmezeit, der Antikörperdichte auf der Oberfläche, der Mitochondrienkonzentration in der Lösung sowie der Flussrate abhängig ist. Weiterhin ist es möglich die immobilisierten Mitochondrien direkt auf dem Chip zu analysieren und zu beobachten, ohne diese zuvor zu eluieren. Dieses Prinzip wurde bei einer Analyse der Atmung von immobilisierten Mitochondrien auf dem Chip gezeigt. Die immobilisierten Mitochondrien waren aktiv und konnten verschiedene Substrate zur Bildung von ATP verwerten. Verschiedene Kanalsegmente konnten unterschiedlich und unabhängig voneinander modifiziert werden. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene Biomarker auf mehreren Kanalsegmenten zu immobilisieren und somit unterschiedliche Organnellen gleichzeitig zu beobachten.
This work introduces a new, affinity based method for isolation of mitochondria on a micro scale after cell disruption. The device comprises of linear micro channels cast in Polydimethylsiloxane (PDMS) and sealed with glass. Using immobilized specific antibodies, mitochondria can be captured in the channel, whereas the remains of the lysate flow out the chip unhindered. Here, successful immobilizations of preconcentrated mitochondria and mitochondria directly from cell lysates are demonstrated. The device was characterized optically using fluorescence microscopy. To better understand the dynamics of the adhesion, a mathematical model was developed. The model was based on the antibody-antigen reaction and included the effect of flow rate on mitochondria immobilization. The model was able to describe the experimental results satisfactorily and is useful for further experimental design. The experimental and the modeling results showed that the yield was influenced by the sampling time, the antibody concentration on the surface, the mitochondria concentration in the sample, as well as the flow rate used during sampling. Further, it is possible to directly observe and analyze the mitochondria on chip without the need to elute them first, e.g. for in-vitro assays on chip. As a proof of principle, in vitro respiration analysis of immobilized mitochondria was performed on chip. The immobilized mitochondria were highly active and able to utilize mitochondrial respiration substrates to produce Adenosine triphosphate (ATP). It was also shown that several segments of the channel can be modified separately from each other. Multiple biomarkers could thus be immobilized in different segments of the channel so that simultaneous observation of different mitochondrial proteins or organelles is possible. Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Energiegewinnung vieler eukaryotischer Zellen. Jedoch werden bis heute die Intermediate vom Zytosol und von Mitochondrien als eine Gesamtheit betrachtet. Aufgrund von fehlenden experimentellen Daten konnten die Dynamik und die regulatorischen Mechanismen in Mitochondrien, beziehungsweise an der Schnittstelle zwischen Zytosol und Mitochondrien bislang noch nicht vollständig geklärt werden. Eine der Schwierigkeiten liegt in der Fraktionierung des hochkomplexen und heterogenen Zelllysats. Standardlabormethoden, wie z.B. die Differentialzentrifugation oder die Elektrophorese können keine Proben unter physiologischen Bedingungen erzeugen. Für Proteomstudien sind diese Methoden nicht spezifisch genug und zudem sehr zeitintensiv.
In dieser Arbeit wurde eine neue mikrofluidische Isolationsmethode für Mitochondrien nach der Zelllyse entwickelt. Die Methode nutzt die Affinität zwischen Antigenen und Antikörpern. Der Mikrochip besteht aus linearen Kanälen in PDMS, welche mit einem Deckglas abgedichtet werden. Spezifische Antikörper gegen Mitochondrien sind auf der Kanaloberfläche immobilisiert, so dass die Mitochondrien in den Kanälen zurückgehalten werden, während der Rest des Zelllysats ungehindert weiterfließen kann. In dieser Arbeit wurde die erfolgreiche Immobilisierung von vorkonzentrierten Mitochondrien sowie Mitochondrien direkt aus dem Zelllysat gezeigt. Der Mikrochip wurde optisch mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Für ein besseres Verständnis der Bindungsdynamik wurde außerdem ein mathematisches Modell erstellt. Das Model basiert auf der Antikörper-Antigen Bindungsreaktion und berücksichtigt den Effekt der Flussrate auf die Immobilisierung der Mitochondrien. Das Modell konnte die experimentellen Daten gut nachbilden und ist für weiteres Experimentdesign sehr nützlich. Sowohl in den experimentellen, als auch in den Simulationsergebnissen wurde gezeigt, dass die Ausbeute von der Probenahmezeit, der Antikörperdichte auf der Oberfläche, der Mitochondrienkonzentration in der Lösung sowie der Flussrate abhängig ist. Weiterhin ist es möglich die immobilisierten Mitochondrien direkt auf dem Chip zu analysieren und zu beobachten, ohne diese zuvor zu eluieren. Dieses Prinzip wurde bei einer Analyse der Atmung von immobilisierten Mitochondrien auf dem Chip gezeigt. Die immobilisierten Mitochondrien waren aktiv und konnten verschiedene Substrate zur Bildung von ATP verwerten. Verschiedene Kanalsegmente konnten unterschiedlich und unabhängig voneinander modifiziert werden. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene Biomarker auf mehreren Kanalsegmenten zu immobilisieren und somit unterschiedliche Organnellen gleichzeitig zu beobachten.
| Erscheinungsdatum | 04.11.2016 |
|---|---|
| Verlagsort | Berlin |
| Sprache | englisch |
| Einbandart | gebunden |
| Themenwelt | Technik ► Umwelttechnik / Biotechnologie |
| Schlagworte | avidin-biotin • covalent protein immobilization • Lab-on-Chip • mitochondria immobilization • PDMS • polydimethylsiloxane |
| ISBN-10 | 3-86387-688-1 / 3863876881 |
| ISBN-13 | 978-3-86387-688-3 / 9783863876883 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
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