Molekularbiologische Untersuchungen zur nicht-ribosomalen Peptidsynthese in Omphalotus olearius
Seiten
2006
|
1., Aufl.
WiKu-Verlag Verlag für Wissenschaft und Kultur
978-3-86553-138-4 (ISBN)
WiKu-Verlag Verlag für Wissenschaft und Kultur
978-3-86553-138-4 (ISBN)
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Ziel der Arbeit war es, Gene für die nicht-ribosomale Peptidsynthese in O. olearius zu
isolieren und zu charakterisieren. Bisher wurden in Basidiomyceten nur zwei NRPSGene mit ihren Produkten in dem Heterobasidiomyceten U. maydis beschrieben.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals drei nicht-ribosomale Peptid Synthetase
(NRPS)-Gene in einem Homobasidiomyceten identifiziert werden.
Neben zahlreichen konventionellen Genfindungsstrategien führte die Mitarbeit an
drei GST-Projekten zur Identifizierung von NRPS-Genfragmenten. Dabei wurden für
das dritte GST-Projekt zwei Fosmidbanken mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese
konstruiert, die zudem für ein „chromosome walking“ über ein neu etabliertes PCR-
„screening“ eingesetzt wurden.
Das NRPS-Gen fso1 (16,3 kb) hatte bei Sequenzvergleichen die höchsten
Homologien zu Siderophorsynthetasen. Die modulare Struktur (ATC-ATC-ATC-TCTC)
ist identisch mit der Ferricrocin-Synthetase SidC aus A. nidulans und der
Ferrichrom A-Synthetase Fer3 aus U. maydis. In Rahmen dieser Arbeit konnte
gezeigt werden, dass O. olearius Ferrichrom A produziert. Um das NRPS-Gen fso1
konnte ein komplettes etwa 22 kb umfassendes Gencluster identifiziert werden.
Dieses Cluster enthält alle für die Ferrichrom A-Synthese essentiellen Enzyme, eine -
L-Ornithin-N5-Monooxygenase (omo1, 2,1 kb) für die Hydroxylierung des L-Ornithins
zum N5-Hydroxyornithin und eine Acyltransferase (ato1, 1,3 kb) für die Acylierung
des N5-Hydroxyornithins zum N5-Methylglutaconyl-N5-Hydroxyornithin. Erstmals
wurde in O. olearius nachgewiesen, dass alle Siderophorbiosynthese-Gene in einem
Cluster organisiert sind. Mittels cDNA-Analysen konnte für fso1 gezeigt werden, dass
der orf in 48 Positionen durch Introns unterbrochen wird. Das ist die bisher höchste
Anzahl von beschriebenen Introns in einem NRPS-Gen. Ein weiteres Indiz, dass die
Gene des fso1-Genclusters für die Biosynthese des Ferrichrom A zuständig sind,
konnte durch Expressionsanalysen via Northern-Blot und „real-time“ PCR gezeigt
werden. Für die Gene fso1 und omo1 konnte unter Eisenmangelbedingungen eine
60- bzw. 10-fache Überexpression gezeigt werden. Neben den hohen Sequenzhomologien sprechen alle diese Punkte für die Vermutung, dass es sich bei Fso1 um die Ferrichrom A-Synthetase aus O. olearius handelt.
Des Weiteren konnte ein zweites potentielles Gencluster (bisher 24 kb) identifiziert
werden. Neben dem putativen NRPS-Gen pso3 (15,7 kb) konnte dabei ein Gen, das
für eine mögliche Aminotransferase (amo1, 1,7 kb) kodiert und Teile eines ABC- und
eines Glyceroltransporter-Gens identifiziert werden. In der modularen Struktur der
NRPS Pso3 (CAT-ATEC-ATC-ATE) konnten die bisher ersten Epimerisierungs-
Domänen bei einem Basidiomyceten beschrieben werden. Zudem kann anhand der
auffälligen Struktur eine nicht lineare Synthesestrategie vermutet werden, die bei
Pilzen bisher noch nicht beschrieben ist. Die höchsten Homologien bestanden bei
pso3 im Gegensatz zu fso1 hauptsächlich zu bakteriellen NRPS.
Das dritte NRPS-Gen (pso4) wurde in Teilen sequenziert. Mit cDNA-Analysen wurde
gezeigt, dass der orf von ca. 5 kb in nur drei Positionen durch Introns unterbrochen
wird und das Gen unter Standardbedingungen exprimiert wird. Die modulare Struktur
(C-ATC) wurde ähnlich wie bei pso3 bisher in Pilzen noch nicht beschrieben.
Durch die Aufklärung der strukturellen Basis der hier beschriebenen NRPS konnte
die Grundlage für die Identifizierung neuer Gene dieses Typs in Homobasidiomyceten
geschaffen werden. Durch die Analyse der einzelnen Domänen konnten starke Homologien zu bakteriellen (pso3) und zu pilzlichen (fso1) NRPS aufgezeigt
werden. Die C-Domänen unterscheiden sich in allen identifizierten NRPS in den
konservierten Bereichen deutlich von den bakteriellen Motiven. Außerdem wurde
deutlich, dass die konservierten Bereiche von NRPS innerhalb einer Art sehr
heterogen sein können.
Mit Hilfe aller bisher charakterisierten Gene aus O. olearius konnte gezeigt werden,
dass 5´- und 3´-Spleißstellen große Ähnlichkeiten zu denen anderer Pilze haben, die
Transkriptionsinitiationssequenzen jedoch von bisher beschriebenen pilzlichen
Konsensussequenzen in mehreren Positionen von dem Kozak-Motiv abweichen
können.
isolieren und zu charakterisieren. Bisher wurden in Basidiomyceten nur zwei NRPSGene mit ihren Produkten in dem Heterobasidiomyceten U. maydis beschrieben.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals drei nicht-ribosomale Peptid Synthetase
(NRPS)-Gene in einem Homobasidiomyceten identifiziert werden.
Neben zahlreichen konventionellen Genfindungsstrategien führte die Mitarbeit an
drei GST-Projekten zur Identifizierung von NRPS-Genfragmenten. Dabei wurden für
das dritte GST-Projekt zwei Fosmidbanken mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese
konstruiert, die zudem für ein „chromosome walking“ über ein neu etabliertes PCR-
„screening“ eingesetzt wurden.
Das NRPS-Gen fso1 (16,3 kb) hatte bei Sequenzvergleichen die höchsten
Homologien zu Siderophorsynthetasen. Die modulare Struktur (ATC-ATC-ATC-TCTC)
ist identisch mit der Ferricrocin-Synthetase SidC aus A. nidulans und der
Ferrichrom A-Synthetase Fer3 aus U. maydis. In Rahmen dieser Arbeit konnte
gezeigt werden, dass O. olearius Ferrichrom A produziert. Um das NRPS-Gen fso1
konnte ein komplettes etwa 22 kb umfassendes Gencluster identifiziert werden.
Dieses Cluster enthält alle für die Ferrichrom A-Synthese essentiellen Enzyme, eine -
L-Ornithin-N5-Monooxygenase (omo1, 2,1 kb) für die Hydroxylierung des L-Ornithins
zum N5-Hydroxyornithin und eine Acyltransferase (ato1, 1,3 kb) für die Acylierung
des N5-Hydroxyornithins zum N5-Methylglutaconyl-N5-Hydroxyornithin. Erstmals
wurde in O. olearius nachgewiesen, dass alle Siderophorbiosynthese-Gene in einem
Cluster organisiert sind. Mittels cDNA-Analysen konnte für fso1 gezeigt werden, dass
der orf in 48 Positionen durch Introns unterbrochen wird. Das ist die bisher höchste
Anzahl von beschriebenen Introns in einem NRPS-Gen. Ein weiteres Indiz, dass die
Gene des fso1-Genclusters für die Biosynthese des Ferrichrom A zuständig sind,
konnte durch Expressionsanalysen via Northern-Blot und „real-time“ PCR gezeigt
werden. Für die Gene fso1 und omo1 konnte unter Eisenmangelbedingungen eine
60- bzw. 10-fache Überexpression gezeigt werden. Neben den hohen Sequenzhomologien sprechen alle diese Punkte für die Vermutung, dass es sich bei Fso1 um die Ferrichrom A-Synthetase aus O. olearius handelt.
Des Weiteren konnte ein zweites potentielles Gencluster (bisher 24 kb) identifiziert
werden. Neben dem putativen NRPS-Gen pso3 (15,7 kb) konnte dabei ein Gen, das
für eine mögliche Aminotransferase (amo1, 1,7 kb) kodiert und Teile eines ABC- und
eines Glyceroltransporter-Gens identifiziert werden. In der modularen Struktur der
NRPS Pso3 (CAT-ATEC-ATC-ATE) konnten die bisher ersten Epimerisierungs-
Domänen bei einem Basidiomyceten beschrieben werden. Zudem kann anhand der
auffälligen Struktur eine nicht lineare Synthesestrategie vermutet werden, die bei
Pilzen bisher noch nicht beschrieben ist. Die höchsten Homologien bestanden bei
pso3 im Gegensatz zu fso1 hauptsächlich zu bakteriellen NRPS.
Das dritte NRPS-Gen (pso4) wurde in Teilen sequenziert. Mit cDNA-Analysen wurde
gezeigt, dass der orf von ca. 5 kb in nur drei Positionen durch Introns unterbrochen
wird und das Gen unter Standardbedingungen exprimiert wird. Die modulare Struktur
(C-ATC) wurde ähnlich wie bei pso3 bisher in Pilzen noch nicht beschrieben.
Durch die Aufklärung der strukturellen Basis der hier beschriebenen NRPS konnte
die Grundlage für die Identifizierung neuer Gene dieses Typs in Homobasidiomyceten
geschaffen werden. Durch die Analyse der einzelnen Domänen konnten starke Homologien zu bakteriellen (pso3) und zu pilzlichen (fso1) NRPS aufgezeigt
werden. Die C-Domänen unterscheiden sich in allen identifizierten NRPS in den
konservierten Bereichen deutlich von den bakteriellen Motiven. Außerdem wurde
deutlich, dass die konservierten Bereiche von NRPS innerhalb einer Art sehr
heterogen sein können.
Mit Hilfe aller bisher charakterisierten Gene aus O. olearius konnte gezeigt werden,
dass 5´- und 3´-Spleißstellen große Ähnlichkeiten zu denen anderer Pilze haben, die
Transkriptionsinitiationssequenzen jedoch von bisher beschriebenen pilzlichen
Konsensussequenzen in mehreren Positionen von dem Kozak-Motiv abweichen
können.
| Zusatzinfo | zahlr. schw.-w. u. farb. Abb. u. Tab. |
|---|---|
| Sprache | deutsch |
| Maße | 210 x 148 mm |
| Einbandart | Paperback |
| Themenwelt | Naturwissenschaften ► Biologie ► Botanik |
| Schlagworte | Basidiomycet • Gencluster • Genfindungsstrategie • HC/Biologie/Botanik • Peptidsynthese • Siderophorbiosynthese |
| ISBN-10 | 3-86553-138-5 / 3865531385 |
| ISBN-13 | 978-3-86553-138-4 / 9783865531384 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
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