Extraktion und chromatographische Analytik von freien Fettsäuren aus Stuhlproben
Seiten
2021
VVB Laufersweiler Verlag
978-3-8359-6982-7 (ISBN)
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Die Zusammensetzung von Säuglings-Formulanahrung sowie die Positionierung der Palmitinsäure innerhalb des Triacylglycerolmoleküls können einen Einfluss auf die Stuhlkonsistenz der Säuglinge haben (Innis et al., 1994). Ein erhöhter sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (Palmitinsäure an mittelständiger sn-2-Position des Glycerolmoleküls verestert) in der Säuglings-Formulanahrung steht im Zusammenhang mit einer Reduktion der Stuhl Fettsäuren-Seifen sowie weicherer Stuhl-Konsistenz bei Säuglingen mit Konstipationsbeschwerden (Bongers et al., 2007). Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zur Extraktion und chromatographischen Analyse von freien Fettsäuren aus Säuglingsstuhlproben zu etablieren und zu validieren.
Da die Gewinnung von Säuglingsstuhlproben in den ersten Lebensmonaten aufgrund von geringen Stuhlmengen eine Herausforderung darstellt, wurde die Analyse mit so geringen Stuhlprobenmengen wie möglich durchgeführt. Es konnte eine Einwaage von 0,1 g Trockenstuhl für die Bestimmung der Gesamt-Fettsäuren sowie eine Einwaage von 0,2 g Trockenstuhl für die Analyse der unverseiften Fettsäuren erreicht werden. Weiterhin sollte die Soxhlet-Analysedauer von 16 Stunden verkürzt werden, um zukünftig mehr Proben in kürzerer Zeit analysieren zu können. Allerdings wurde aufgrund der schlechteren VK-Werte bei einer verkürzten 12-stündigen Soxhlet-Analysezeit für die Methodenetablierung die 16-stündige Soxhlet-Extraktion gewählt.
Weiterführend wurde die etablierte Methode im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie eingesetzt. Ziel der Studie war es, die Ausscheidung der Fettsäuren-Seifen, organische Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren und das Fettsäurenprofil der Erythrozytenmembran von Säuglingen, die entweder mit einer modifizierten Formulanahrung (Verum) mit einem erhöhten sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (25,4 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung), unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS, oder einer Standard-Formularnahrung (Kontrolle) (< 10 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung innerhalb des Glycerolmoleküls) gefüttert worden sind, zu untersuchen. Parallel hierzu wurde eine nicht-randomisierte Gruppe mit Muttermilch-ernährten Säuglingen untersucht.
Die Stuhlproben wurden im Alter von 37 - 47 Lebenstagen (Studientag 2 = ST2) gesammelt und gefriergetrocknet. Die Lipidextraktion der Gesamt-Fettsäuren erfolgte mit Hilfe einer Petrolether/Salzsäure-Mischung. Nach Trennung der Petrolether/Fettsäuren-Schicht und Trocknung wurde die Probe in Chloroform gelöst und für die Derivatisierung vorbereitet. Die unverseiften Fettsäuren wurden mit Hilfe der Soxhlet-Anlage 16 Stunden mit Petrolether extrahiert. Nach Trocknung der Probe wurde diese in Chloroform gelöst und ebenfalls für die Derivatisierung vorbereitet. Zur Umwandlung der Fettsäuren in Methylester wurden die Proben zuerst mit Chloroform behandelt und mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie separiert. Die Banden der freien Fettsäuren wurden in ein Röhrchen gefüllt und mit dem Methylierungsreagenz (Methanol/Salzsäure) bei 95 °C für vier Stunden inkubiert. Am Ende konnten die Proben in Heptan gelöst und mit Hilfe der Gaschromatographie analysiert werden (Varian medical systems, Palo Alto, USA). Die verseiften Fettsäuren wurden aus der Differenz der Gesamt- und unverseiften Fettsäuren arithmetisch berechnet. Die Fettsäuren-Seifen wurden in µmol pro g Trockenstuhl dargestellt. Für die Analyse der organischen Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren wurden die Proben mit Wasser und Acetonitril behandelt und nach anschließender Filtration mit Hilfe der HPLC analysiert. Die venösen Blutproben wurden im Alter von 3 - 10 Lebenstagen (Studientag 1 = ST1) und an ST2 gesammelt, um sicherzustellen, dass die modifizierte Formulanahrung mit hohem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt keinen negativen Effekt auf die essenziellen Fettsäuren hatte. Die Fütterungsmengen der Formula-Gruppen wurden zu ST2 und ST3 (Studientag 3 = Alter von 77 - 91 Lebenstagen) und die anthropometrischen Messungen an ST1 und ST3 erhoben.
Die Ergebnisse zeigten, dass es keine Unterschiede hinsichtlich der Fettsäuren-Seifen-, Palmitin-Seifen-, Gesamt-Fettsäuren- und organische Säuren- einschließlich SCFAs-Konzentrationen in den Stuhlproben zwischen der Verum- und Kontroll-Gruppe gab. Allerdings wies die MM-Gruppe signifikant niedrigere Konzentrationen der ausgeschiedenen Fettsäuren-Seifen, Palmitinsäure-Seife, Gesamt-Fettsäuren sowie der SCFAs Essig- und Propionsäure und höhere Konzentrationen der Ameisen- und Brenztraubensäure im Vergleich zur Verum- und Kontroll-Gruppe auf. Der Gehalt der LA (C 18:2n6) und ALA (C 18:3n3) stieg in den Erythrozyten der Säuglinge in allen drei Gruppen von ST1 zu ST2 signifikant an. Die Kontroll-Gruppe wies signifikant niedrigere AA und DHA Konzentrationen im Vergleich zur MM-Gruppe zu ST2 auf. Die Säuglinge, welche eine modifizierte Formula mit erhöhtem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS erhielten, zeigten nicht die erwarteten positiven Effekte bezüglich der Fettsäuren-Zusammensetzung im Stuhl.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der entwickelten Methodik für die durchgeführte klinische Interventionsstudie ausreichend sind. Eine Verbesserung der hier entwickelten Methodik würde zu keiner signifikanten Verbesserung der klinischen Interventionsstudieergebnisse führen. Composition of infant formula and the position of palmitic acid (PA) within the triacylglycerol molecule can affect stool consistency (Innis et al., 1994). Infant formula high in sn-2-palmitate content (PA esterified in the middle sn-2-position of the glycerol molecule) lead to softer stools and reduce fecal fatty acid soaps in infants with constipation complaints (Bongers et al., 2007). The aim of this present thesis was to establish and validate an extraction method and chromatographic analysis of free fatty acids from infants stools.
Collecting infants fecal samples in the first months after birth is challenging because of the small quantity, for this reason the fecal quantity for the analysis was minimized as far as possible. The weight of fecal sample taken for the lipid extraction of fecal total FAs was 0.1 g dry weight stool and for the analysis of fecal unsaponified FAs the weight of stool sample was 0.2 g dry weight stool. Furthermore, the duration of lipid extraction of fecal unsaponified FAs with petroleum ether by refluxing 16 hours (Soxhlet) was to be minimized to achieve the analysis of more samples in less time. However, because of poorer values of variance after 12 hour versus 16 hour extraction (Soxhlet) the extraction was carried out with an analysis duration of 16 hours.
The established method was further applied in the context of a clinical intervention study. The aim of the study was to compare the fecal excretion of FA soaps, organic acids including SCFAs and the FA profile in erythrocyte membrane of infants fed a high-sn-2-palmitate formula (25.4 % of the PA esterified to sn-2-position) supplemented with 0.5 g/100 ml GOS versus a regular infant formula (< 10% of the PA esterified to sn-2-position of the glycerol backbone). At the same time a non-randomized group nursed with human milk was studied.
The stool samples were collected at the age of 37 - 47 days (study day 2) and freeze-dried. Lipid extraction of fecal total FAs was performed using petroleum ether/hydrochloric acid mixture. After separating the petroleum ether/FA layer and drying, the sample was solved in chloroform and prepared for derivation. Unsaponified FAs were extracted by 16 hours Soxhlet extraction using petroleum ether. After drying, the sample was solved in chloroform and prepared for derivation. To convert the total FAs and unsaponified FAs into methyl esters, the samples were treated with chloroform and separated with thin layer chromatography. The band with free FAs was transferred into a small vial, methylated using methanol/HCl, and incubated at 95 °C for four hours. The samples were solved in heptane and then analyzed using gas chromatographic analysis (Varian medical systems, Palo Alto, USA). The fecal saponified FAs were arithmetically calculated as the difference between the analytically determined total and unsaponified FAs. The amount of saponified FAs are represented as µmol per g of dry weight stool. For the analysis of organic acids including SCFAs, wet stool samples were treated with water and acetonitril and analyzed after filtration with HPLC. Infant venous blood samples were collected at the age of 3 - 10 days (study day 1) and at study day 2 to examine if the modified high-sn-2-palmitate formula had negative effects on the incorporation of essential FAs. The formula intake was recorded at study day 2 and study day 3 (at the age of 77 - 91 days) and the anthropometric measurements were performed on study day 1 and study day 3.
There was no significant difference for the fecal amount of total FA soaps, PA soaps, total FAs and organic acids including SCFAs between verum and control group. The group nursed with human milk had significantly lower total FA soaps, PA soaps, total FAs, acetic acid, propionic acid and higher formic acid as well as pyruvic acid than the verum and control group. Linoleic acid (C 18:2n6) and alpha-linolenic acid (C 18:3n3) content in the erythrocytes increased significantly in all three groups from study day 1 to study day 2. The control group demonstrated significantly lower arachidonic acid (AA) and docosahexaenoic acid (DHA) levels in the erythrocytes than the group nursed with human milk at study day 2 (infants aged 37 - 47 days). Infants fed with high sn-2-palmitate formula supplemented with 0.5 g/100 ml GOS did not show the expected positive effects regarding the fecal fatty acid composition.
In summary, the precision and reproducibility of the developed methods for the implemented clinical intervention study was shown to be sufficient. An improvement of the developed methodology would therefore not result in a significant improvement of the clinical intervention study results.
Da die Gewinnung von Säuglingsstuhlproben in den ersten Lebensmonaten aufgrund von geringen Stuhlmengen eine Herausforderung darstellt, wurde die Analyse mit so geringen Stuhlprobenmengen wie möglich durchgeführt. Es konnte eine Einwaage von 0,1 g Trockenstuhl für die Bestimmung der Gesamt-Fettsäuren sowie eine Einwaage von 0,2 g Trockenstuhl für die Analyse der unverseiften Fettsäuren erreicht werden. Weiterhin sollte die Soxhlet-Analysedauer von 16 Stunden verkürzt werden, um zukünftig mehr Proben in kürzerer Zeit analysieren zu können. Allerdings wurde aufgrund der schlechteren VK-Werte bei einer verkürzten 12-stündigen Soxhlet-Analysezeit für die Methodenetablierung die 16-stündige Soxhlet-Extraktion gewählt.
Weiterführend wurde die etablierte Methode im Rahmen einer klinischen Interventionsstudie eingesetzt. Ziel der Studie war es, die Ausscheidung der Fettsäuren-Seifen, organische Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren und das Fettsäurenprofil der Erythrozytenmembran von Säuglingen, die entweder mit einer modifizierten Formulanahrung (Verum) mit einem erhöhten sn-2-Palmitinsäure-Gehalt (25,4 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung), unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS, oder einer Standard-Formularnahrung (Kontrolle) (< 10 % Palmitinsäure in sn-2-Veresterung innerhalb des Glycerolmoleküls) gefüttert worden sind, zu untersuchen. Parallel hierzu wurde eine nicht-randomisierte Gruppe mit Muttermilch-ernährten Säuglingen untersucht.
Die Stuhlproben wurden im Alter von 37 - 47 Lebenstagen (Studientag 2 = ST2) gesammelt und gefriergetrocknet. Die Lipidextraktion der Gesamt-Fettsäuren erfolgte mit Hilfe einer Petrolether/Salzsäure-Mischung. Nach Trennung der Petrolether/Fettsäuren-Schicht und Trocknung wurde die Probe in Chloroform gelöst und für die Derivatisierung vorbereitet. Die unverseiften Fettsäuren wurden mit Hilfe der Soxhlet-Anlage 16 Stunden mit Petrolether extrahiert. Nach Trocknung der Probe wurde diese in Chloroform gelöst und ebenfalls für die Derivatisierung vorbereitet. Zur Umwandlung der Fettsäuren in Methylester wurden die Proben zuerst mit Chloroform behandelt und mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie separiert. Die Banden der freien Fettsäuren wurden in ein Röhrchen gefüllt und mit dem Methylierungsreagenz (Methanol/Salzsäure) bei 95 °C für vier Stunden inkubiert. Am Ende konnten die Proben in Heptan gelöst und mit Hilfe der Gaschromatographie analysiert werden (Varian medical systems, Palo Alto, USA). Die verseiften Fettsäuren wurden aus der Differenz der Gesamt- und unverseiften Fettsäuren arithmetisch berechnet. Die Fettsäuren-Seifen wurden in µmol pro g Trockenstuhl dargestellt. Für die Analyse der organischen Säuren einschließlich kurzkettigen Fettsäuren wurden die Proben mit Wasser und Acetonitril behandelt und nach anschließender Filtration mit Hilfe der HPLC analysiert. Die venösen Blutproben wurden im Alter von 3 - 10 Lebenstagen (Studientag 1 = ST1) und an ST2 gesammelt, um sicherzustellen, dass die modifizierte Formulanahrung mit hohem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt keinen negativen Effekt auf die essenziellen Fettsäuren hatte. Die Fütterungsmengen der Formula-Gruppen wurden zu ST2 und ST3 (Studientag 3 = Alter von 77 - 91 Lebenstagen) und die anthropometrischen Messungen an ST1 und ST3 erhoben.
Die Ergebnisse zeigten, dass es keine Unterschiede hinsichtlich der Fettsäuren-Seifen-, Palmitin-Seifen-, Gesamt-Fettsäuren- und organische Säuren- einschließlich SCFAs-Konzentrationen in den Stuhlproben zwischen der Verum- und Kontroll-Gruppe gab. Allerdings wies die MM-Gruppe signifikant niedrigere Konzentrationen der ausgeschiedenen Fettsäuren-Seifen, Palmitinsäure-Seife, Gesamt-Fettsäuren sowie der SCFAs Essig- und Propionsäure und höhere Konzentrationen der Ameisen- und Brenztraubensäure im Vergleich zur Verum- und Kontroll-Gruppe auf. Der Gehalt der LA (C 18:2n6) und ALA (C 18:3n3) stieg in den Erythrozyten der Säuglinge in allen drei Gruppen von ST1 zu ST2 signifikant an. Die Kontroll-Gruppe wies signifikant niedrigere AA und DHA Konzentrationen im Vergleich zur MM-Gruppe zu ST2 auf. Die Säuglinge, welche eine modifizierte Formula mit erhöhtem sn-2-Palmitinsäure-Gehalt unter Zugabe von 0,5 g/100 ml GOS erhielten, zeigten nicht die erwarteten positiven Effekte bezüglich der Fettsäuren-Zusammensetzung im Stuhl.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der entwickelten Methodik für die durchgeführte klinische Interventionsstudie ausreichend sind. Eine Verbesserung der hier entwickelten Methodik würde zu keiner signifikanten Verbesserung der klinischen Interventionsstudieergebnisse führen. Composition of infant formula and the position of palmitic acid (PA) within the triacylglycerol molecule can affect stool consistency (Innis et al., 1994). Infant formula high in sn-2-palmitate content (PA esterified in the middle sn-2-position of the glycerol molecule) lead to softer stools and reduce fecal fatty acid soaps in infants with constipation complaints (Bongers et al., 2007). The aim of this present thesis was to establish and validate an extraction method and chromatographic analysis of free fatty acids from infants stools.
Collecting infants fecal samples in the first months after birth is challenging because of the small quantity, for this reason the fecal quantity for the analysis was minimized as far as possible. The weight of fecal sample taken for the lipid extraction of fecal total FAs was 0.1 g dry weight stool and for the analysis of fecal unsaponified FAs the weight of stool sample was 0.2 g dry weight stool. Furthermore, the duration of lipid extraction of fecal unsaponified FAs with petroleum ether by refluxing 16 hours (Soxhlet) was to be minimized to achieve the analysis of more samples in less time. However, because of poorer values of variance after 12 hour versus 16 hour extraction (Soxhlet) the extraction was carried out with an analysis duration of 16 hours.
The established method was further applied in the context of a clinical intervention study. The aim of the study was to compare the fecal excretion of FA soaps, organic acids including SCFAs and the FA profile in erythrocyte membrane of infants fed a high-sn-2-palmitate formula (25.4 % of the PA esterified to sn-2-position) supplemented with 0.5 g/100 ml GOS versus a regular infant formula (< 10% of the PA esterified to sn-2-position of the glycerol backbone). At the same time a non-randomized group nursed with human milk was studied.
The stool samples were collected at the age of 37 - 47 days (study day 2) and freeze-dried. Lipid extraction of fecal total FAs was performed using petroleum ether/hydrochloric acid mixture. After separating the petroleum ether/FA layer and drying, the sample was solved in chloroform and prepared for derivation. Unsaponified FAs were extracted by 16 hours Soxhlet extraction using petroleum ether. After drying, the sample was solved in chloroform and prepared for derivation. To convert the total FAs and unsaponified FAs into methyl esters, the samples were treated with chloroform and separated with thin layer chromatography. The band with free FAs was transferred into a small vial, methylated using methanol/HCl, and incubated at 95 °C for four hours. The samples were solved in heptane and then analyzed using gas chromatographic analysis (Varian medical systems, Palo Alto, USA). The fecal saponified FAs were arithmetically calculated as the difference between the analytically determined total and unsaponified FAs. The amount of saponified FAs are represented as µmol per g of dry weight stool. For the analysis of organic acids including SCFAs, wet stool samples were treated with water and acetonitril and analyzed after filtration with HPLC. Infant venous blood samples were collected at the age of 3 - 10 days (study day 1) and at study day 2 to examine if the modified high-sn-2-palmitate formula had negative effects on the incorporation of essential FAs. The formula intake was recorded at study day 2 and study day 3 (at the age of 77 - 91 days) and the anthropometric measurements were performed on study day 1 and study day 3.
There was no significant difference for the fecal amount of total FA soaps, PA soaps, total FAs and organic acids including SCFAs between verum and control group. The group nursed with human milk had significantly lower total FA soaps, PA soaps, total FAs, acetic acid, propionic acid and higher formic acid as well as pyruvic acid than the verum and control group. Linoleic acid (C 18:2n6) and alpha-linolenic acid (C 18:3n3) content in the erythrocytes increased significantly in all three groups from study day 1 to study day 2. The control group demonstrated significantly lower arachidonic acid (AA) and docosahexaenoic acid (DHA) levels in the erythrocytes than the group nursed with human milk at study day 2 (infants aged 37 - 47 days). Infants fed with high sn-2-palmitate formula supplemented with 0.5 g/100 ml GOS did not show the expected positive effects regarding the fecal fatty acid composition.
In summary, the precision and reproducibility of the developed methods for the implemented clinical intervention study was shown to be sufficient. An improvement of the developed methodology would therefore not result in a significant improvement of the clinical intervention study results.
| Erscheinungsdatum | 10.01.2022 |
|---|---|
| Reihe/Serie | Edition Scientifique |
| Verlagsort | Gießen |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 148 x 210 mm |
| Gewicht | 150 g |
| Themenwelt | Naturwissenschaften ► Chemie ► Technische Chemie |
| Weitere Fachgebiete ► Land- / Forstwirtschaft / Fischerei | |
| Schlagworte | Chymus • Ernährung • Fett • Fettsäuren • Lipide • SCFA • Verdauung |
| ISBN-10 | 3-8359-6982-X / 383596982X |
| ISBN-13 | 978-3-8359-6982-7 / 9783835969827 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
| Haben Sie eine Frage zum Produkt? |
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