Spektro-mikroskopische Charakterisierung von Nano-Bio-Wechselwirkungen in Zellen
Seiten
2017
|
1. Aufl.
Mensch & Buch (Verlag)
978-3-86387-777-4 (ISBN)
Mensch & Buch (Verlag)
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In this thesis, the interaction of nanoparticles of different physico-chemical properties with eukaryotic cells (fibroblasts, macrophages, and erythrocytes) was investigated in the context of cellular uptake, processing and cytotoxicity of the nanoparticles. Complementary spectroscopic and microscopic methods were used to study the chemical environment of gold, silver and silica nanoparticles and their distribution within the cellular ultrastructure. The cytotoxic effects were investigated by XTT and live-dead biological tests.
The molecular environment of gold and silver nanoparticles inside the cell during uptake and processing was studied by surface-enhanced Raman scattering (SERS) microscopy. Intrinsic information about the biomolecules in the very proximity of the particle surface or from label molecules, such as molecules that measure intra-endosomal pH, were obtained. This allowed to draw conclusions about the molecular composition of the nanoparticles’ corona in live cells and about molecular changes in the course of endosomal maturation, and to verify transport mechanisms. Multiplexing experiments using different SERS probes prove the capabilities of SERS to differentiate the cellular uptake behavior of different nanoprobes. For the first time, X-ray tomography of cryofixed cells (cryo-XT) was utilized for the visualization of the 3-dimensional particle distribution and arrangement of nanoparticles in the cellular ultrastructure in whole vitrified cells. These experiments illustrate the uptake of the particles by endocytosis and phagocytosis and the encapsulation in vesicles within the cells. A quantitative method based on laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) was established and applied to determine the number of different types of internalized nanoparticles at the single-cell level. This involved the development of a new, matrix-matched calibration procedure for particle quantification with LA-ICP-MS.
In order to adopt the SERS capabilities of novel metal nanoparticles to other particle surfaces and to study the properties of other nanomaterials, core-shell particles were designed, which provide spectral information on the silica nano-bio-interaction inside eukaryotic cells (BrightSilica). The metal core also enables quantification of the BrightSilica nanoparticles using LA-ICP-MS micromapping and localization in the 3D cellular ultrastructure by cryo-XT.
Processing of the nanoparticles studied here and their interaction with the cells and with the biomolecules show strong dependence on the chemical nature of the nanoparticle in contact with the cells as well as on their aggregate geometry, formation of a biomolecule corona through adsorption of proteins, particle size and other parameters. With the results of this thesis, methodological progress with respect to the development and combination of analytical methods is demonstrated. Furthermore, new aspects in nanoparticle interaction with complex biological systems are identified. Die Untersuchung von Nano-Bio-Wechselwirkungen hat in den vergangenen Jahren immer mehr an Relevanz gewonnen. Diese Entwicklung wird einerseits durch die immer weitere Verbreitung von Nanopartikeln in Alltagsprodukten, in den Materialwissenschaften sowie in der biomedizinischen Forschung und andererseits durch besser werdende Analyseverfahren vorangetrieben.
Dennoch gibt es über die potentiellen Risiken von nanopartikulärem Material und die damit verknüpften Folgen für Mensch und Umwelt zahlreiche offene Fragen. Während eine grundlegende Gefährdung für die Gesundheit bereits erwiesen ist, sind mögliche Mechanismen der Aufnahme, des Transports und der Toxizität von verschiedenen Nanomaterialien in unterschiedlichen biologischen Systemen teilweise unbekannt. Das zytotoxische Wirkungsspektrum von Nanopartikeln reicht von metabolischen Einflüssen bis hin zu DNA‐Schädigungen, da sie aufgrund ihrer Größe die Zellmembran und andere intrazelluläre Barrieren durchdringen können.
Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss verschiedener Nanopartikel auf komplexe biologische Systeme, wie lebende Zellen, durch die Verwendung komplementärer analytischer Verfahren zu betrachten. Als biologisches Referenzsystem werden verschiedene Zelllinien, 3T3 Fibroblasten und J744 Makrophagen, sowie aus Blut isolierte rote Blutkörperchen verwendet. Diese Zelltypen zeichnen sich durch unterschiedliche biologische Funktionen und Mechanismen der Partikelaufnahme aus, so dass Rückschlüsse auf die Wechselwirkung von Nanopartikeln in komplexeren Organismen gezogen werden können. Für die Untersuchung der Nano-Bio-Wechselwirkungen werden Gold-, Silber-, Silica- und Polystyren-Nanopartikel mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (chemische Zusammensetzung, Größe, Oberflächenmodifikation, Form) eingesetzt, die entsprechend ihrer spezifischen Eigenschaften unterschiedliche Analysemethoden erfordern.
Mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (engl. surface-enhanced Raman scattering, SERS) soll die biochemische Umgebung von Gold- und Silber-Nanopartikeln charakterisiert werden. Diese Materialien sind aufgrund ihrer plasmonischen Eigenschaften als SERS-Substrate sehr gut geeignet. Anhand der SERS-Daten sollen Änderungen der molekularen Zusammensetzung auf der Partikeloberfläche bei Aufnahme und Transport von Nanopartikeln in lebenden Zellen verfolgt werden. Neben der endozytotischen Aufnahme von Gold- und Silber-Nanopartikeln soll auch die in situ-Bildung von Nanopartikeln durch zelluläre Bestandteile innerhalb der Zellen betrachtet werden. Durch die Verwendung von Reportermolekülen auf Gold-Nanopartikeln können auch wichtige zelluläre Parameter, wie der endosomale pH‐Wert, bestimmt werden. Ziel ist es, die Wirkung von Gold-, Silber- und Silica-Nanopartikeln mittels zellbiologischer Zytotoxizitätstests und systematischer SERS-Studien in Abhängigkeit von verschiedenen Inkubationsbedingungen besser zu verstehen.
Die spektroskopischen Informationen werden durch weitere Analysemethoden ergänzt. Dies sind zum einen Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und cryo-Röntgentomographie (cryo-XT), welche die Lokalisation der Nanopartikel in der zellulären Ultrastruktur erlauben. In diesem Zusammenhang soll erstmals gezeigt werden, ob cryo-XT unter Verwendung von weicher Röntgenstrahlung die 3D-Verteilung der Nanopartikel und ihrer Aggregate mit einer Auflösung von wenigen Nanometern sichtbar macht. Zum anderen soll die Laserablation mit induktivgekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) im Rahmen dieser Arbeit für die ortsaufgelöste Quantifizierung der Partikelanzahl auf Einzelzellniveau entwickelt und angewendet werden. Derzeit werden anorganische Nanopartikel üblicherweise über eine Elementbestimmung nach Aufschluss einer Zellsuspension quantifiziert. Polystyren-Nanopartikel (PSNP) sind mittels TEM und cryo-XT nur eingeschränkt visualisierbar. Deshalb werden hier fluoreszenzmarkierte Partikel für die Untersuchung der Aufnahme und Prozessierung verwendet. Die Verteilung von unterschiedlich großen, farbstoffbeladenen PSNP in Zellen soll mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (engl. confocal laser scanning microscopy, CLSM) und Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (engl. fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) dargestellt werden. Um die Komplexität des Systems zu erhöhen, werden Zellen in Monokultur als auch in Co-Kultur mit verschiedenen Nanopartikeln simultan inkubiert. In Multiplex-Experimenten soll die Diskriminierung der Partikel durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter PSNP und ihrer unterschiedlichen Fluoreszenz-Lebensdauer erreicht werden.
Um den Einfluss von Nanopartikeln auf Zellen zu bewerten, werden in dieser Arbeit die folgenden spezifischen Aspekte betrachtet: (i) Für die Anwendung in in vitro-Zellkulturexperimenten werden die Partikel zunächst bezüglich ihrer Größe, Ladung und Oberflächenmodifikation unter Inkubationsbedingungen umfassend charakterisiert und optimiert sowie ihre Toxizität bestimmt. (ii) Es werden SERS-Spektren von verschiedenen plasmonischen Nanomaterialien und aus unterschiedlichen biochemischen Umgebungen in Zellen diskutiert. (iii) Die spektrale Information wird mit der Lokalisation der Partikel und ihrer Aggregatmorphologie sowie ihrer quantitativen Verteilung in der Zelle verknüpft.
Die Kombination komplementärer Informationen aus verschiedenen Analyseverfahren gestattet Einblicke in die Wechselwirkungen an der Nano-Bio-Grenzfläche und den Umgang lebender Zellen mit Nanopartikeln. Diese Ergebnisse haben somit direkte Auswirkungen auf die Entwicklung neuartiger Biosensoren in der Medizin, die Definition von Nanopartikelgrenzwerten oder auf verschiedene Anwendungen in der Bioanalytik.
The molecular environment of gold and silver nanoparticles inside the cell during uptake and processing was studied by surface-enhanced Raman scattering (SERS) microscopy. Intrinsic information about the biomolecules in the very proximity of the particle surface or from label molecules, such as molecules that measure intra-endosomal pH, were obtained. This allowed to draw conclusions about the molecular composition of the nanoparticles’ corona in live cells and about molecular changes in the course of endosomal maturation, and to verify transport mechanisms. Multiplexing experiments using different SERS probes prove the capabilities of SERS to differentiate the cellular uptake behavior of different nanoprobes. For the first time, X-ray tomography of cryofixed cells (cryo-XT) was utilized for the visualization of the 3-dimensional particle distribution and arrangement of nanoparticles in the cellular ultrastructure in whole vitrified cells. These experiments illustrate the uptake of the particles by endocytosis and phagocytosis and the encapsulation in vesicles within the cells. A quantitative method based on laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS) was established and applied to determine the number of different types of internalized nanoparticles at the single-cell level. This involved the development of a new, matrix-matched calibration procedure for particle quantification with LA-ICP-MS.
In order to adopt the SERS capabilities of novel metal nanoparticles to other particle surfaces and to study the properties of other nanomaterials, core-shell particles were designed, which provide spectral information on the silica nano-bio-interaction inside eukaryotic cells (BrightSilica). The metal core also enables quantification of the BrightSilica nanoparticles using LA-ICP-MS micromapping and localization in the 3D cellular ultrastructure by cryo-XT.
Processing of the nanoparticles studied here and their interaction with the cells and with the biomolecules show strong dependence on the chemical nature of the nanoparticle in contact with the cells as well as on their aggregate geometry, formation of a biomolecule corona through adsorption of proteins, particle size and other parameters. With the results of this thesis, methodological progress with respect to the development and combination of analytical methods is demonstrated. Furthermore, new aspects in nanoparticle interaction with complex biological systems are identified. Die Untersuchung von Nano-Bio-Wechselwirkungen hat in den vergangenen Jahren immer mehr an Relevanz gewonnen. Diese Entwicklung wird einerseits durch die immer weitere Verbreitung von Nanopartikeln in Alltagsprodukten, in den Materialwissenschaften sowie in der biomedizinischen Forschung und andererseits durch besser werdende Analyseverfahren vorangetrieben.
Dennoch gibt es über die potentiellen Risiken von nanopartikulärem Material und die damit verknüpften Folgen für Mensch und Umwelt zahlreiche offene Fragen. Während eine grundlegende Gefährdung für die Gesundheit bereits erwiesen ist, sind mögliche Mechanismen der Aufnahme, des Transports und der Toxizität von verschiedenen Nanomaterialien in unterschiedlichen biologischen Systemen teilweise unbekannt. Das zytotoxische Wirkungsspektrum von Nanopartikeln reicht von metabolischen Einflüssen bis hin zu DNA‐Schädigungen, da sie aufgrund ihrer Größe die Zellmembran und andere intrazelluläre Barrieren durchdringen können.
Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss verschiedener Nanopartikel auf komplexe biologische Systeme, wie lebende Zellen, durch die Verwendung komplementärer analytischer Verfahren zu betrachten. Als biologisches Referenzsystem werden verschiedene Zelllinien, 3T3 Fibroblasten und J744 Makrophagen, sowie aus Blut isolierte rote Blutkörperchen verwendet. Diese Zelltypen zeichnen sich durch unterschiedliche biologische Funktionen und Mechanismen der Partikelaufnahme aus, so dass Rückschlüsse auf die Wechselwirkung von Nanopartikeln in komplexeren Organismen gezogen werden können. Für die Untersuchung der Nano-Bio-Wechselwirkungen werden Gold-, Silber-, Silica- und Polystyren-Nanopartikel mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften (chemische Zusammensetzung, Größe, Oberflächenmodifikation, Form) eingesetzt, die entsprechend ihrer spezifischen Eigenschaften unterschiedliche Analysemethoden erfordern.
Mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (engl. surface-enhanced Raman scattering, SERS) soll die biochemische Umgebung von Gold- und Silber-Nanopartikeln charakterisiert werden. Diese Materialien sind aufgrund ihrer plasmonischen Eigenschaften als SERS-Substrate sehr gut geeignet. Anhand der SERS-Daten sollen Änderungen der molekularen Zusammensetzung auf der Partikeloberfläche bei Aufnahme und Transport von Nanopartikeln in lebenden Zellen verfolgt werden. Neben der endozytotischen Aufnahme von Gold- und Silber-Nanopartikeln soll auch die in situ-Bildung von Nanopartikeln durch zelluläre Bestandteile innerhalb der Zellen betrachtet werden. Durch die Verwendung von Reportermolekülen auf Gold-Nanopartikeln können auch wichtige zelluläre Parameter, wie der endosomale pH‐Wert, bestimmt werden. Ziel ist es, die Wirkung von Gold-, Silber- und Silica-Nanopartikeln mittels zellbiologischer Zytotoxizitätstests und systematischer SERS-Studien in Abhängigkeit von verschiedenen Inkubationsbedingungen besser zu verstehen.
Die spektroskopischen Informationen werden durch weitere Analysemethoden ergänzt. Dies sind zum einen Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und cryo-Röntgentomographie (cryo-XT), welche die Lokalisation der Nanopartikel in der zellulären Ultrastruktur erlauben. In diesem Zusammenhang soll erstmals gezeigt werden, ob cryo-XT unter Verwendung von weicher Röntgenstrahlung die 3D-Verteilung der Nanopartikel und ihrer Aggregate mit einer Auflösung von wenigen Nanometern sichtbar macht. Zum anderen soll die Laserablation mit induktivgekoppelter Plasma-Massenspektrometrie (LA-ICP-MS) im Rahmen dieser Arbeit für die ortsaufgelöste Quantifizierung der Partikelanzahl auf Einzelzellniveau entwickelt und angewendet werden. Derzeit werden anorganische Nanopartikel üblicherweise über eine Elementbestimmung nach Aufschluss einer Zellsuspension quantifiziert. Polystyren-Nanopartikel (PSNP) sind mittels TEM und cryo-XT nur eingeschränkt visualisierbar. Deshalb werden hier fluoreszenzmarkierte Partikel für die Untersuchung der Aufnahme und Prozessierung verwendet. Die Verteilung von unterschiedlich großen, farbstoffbeladenen PSNP in Zellen soll mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (engl. confocal laser scanning microscopy, CLSM) und Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (engl. fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) dargestellt werden. Um die Komplexität des Systems zu erhöhen, werden Zellen in Monokultur als auch in Co-Kultur mit verschiedenen Nanopartikeln simultan inkubiert. In Multiplex-Experimenten soll die Diskriminierung der Partikel durch die Verwendung fluoreszenzmarkierter PSNP und ihrer unterschiedlichen Fluoreszenz-Lebensdauer erreicht werden.
Um den Einfluss von Nanopartikeln auf Zellen zu bewerten, werden in dieser Arbeit die folgenden spezifischen Aspekte betrachtet: (i) Für die Anwendung in in vitro-Zellkulturexperimenten werden die Partikel zunächst bezüglich ihrer Größe, Ladung und Oberflächenmodifikation unter Inkubationsbedingungen umfassend charakterisiert und optimiert sowie ihre Toxizität bestimmt. (ii) Es werden SERS-Spektren von verschiedenen plasmonischen Nanomaterialien und aus unterschiedlichen biochemischen Umgebungen in Zellen diskutiert. (iii) Die spektrale Information wird mit der Lokalisation der Partikel und ihrer Aggregatmorphologie sowie ihrer quantitativen Verteilung in der Zelle verknüpft.
Die Kombination komplementärer Informationen aus verschiedenen Analyseverfahren gestattet Einblicke in die Wechselwirkungen an der Nano-Bio-Grenzfläche und den Umgang lebender Zellen mit Nanopartikeln. Diese Ergebnisse haben somit direkte Auswirkungen auf die Entwicklung neuartiger Biosensoren in der Medizin, die Definition von Nanopartikelgrenzwerten oder auf verschiedene Anwendungen in der Bioanalytik.
| Erscheinungsdatum | 09.11.2017 |
|---|---|
| Verlagsort | Berlin |
| Sprache | deutsch |
| Maße | 1480 x 2100 mm |
| Gewicht | 620 g |
| Themenwelt | Naturwissenschaften ► Chemie ► Physikalische Chemie |
| Schlagworte | eukaryotische Zellen • Nanopartikel • SERS • Zellen • zelluläre Aufnahme • zelluläre Ultrastruktur |
| ISBN-10 | 3-86387-777-2 / 3863877772 |
| ISBN-13 | 978-3-86387-777-4 / 9783863877774 |
| Zustand | Neuware |
| Informationen gemäß Produktsicherheitsverordnung (GPSR) | |
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